用RNAseq快速繪制大腦圖

　　在過去的十年中，DNA和RNA測序技術已迅猛發展并且更加便宜，現在它們被運用到各種新的領域中。最近在《Neuron》發表的一項新研究中，研究人員使用RNA測序技術，在單個神經元水平上繪制小鼠的大腦圖。這種新技術被稱為Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing (MAPseq)，可能比目前的方案更快和更容易。延伸閱讀：華人學者構建新的大腦圖譜；《科學》：迄今為止最詳細的大腦連接圖 。

　　這項研究的第一作者、冷泉港實驗室Anthony Zador教授的研究生Justus Kebschull說：“有了MAPseq，我們試圖查明單個神經元最終到達哪里。”Zador的團隊積極開發MAPseq，因為缺乏高通量方法來跟蹤單個神經元。

　　在這項新的研究中，研究人員向一個選定的腦區，注射了一種含有大量RNA分子的失活病毒。每個RNA分子都有其獨特的“條碼”序列，每一個都在一個神經元中結束，并通過軸突。幾天之后，研究人員解剖大腦，收集和測定來自不同腦區的RNA條形碼。

　　通過將來自注射腦區與其他腦區的RNA條碼進行匹配，研究人員可以追蹤單個神經元最終到達哪里。Kebschull說：“這是利用測序和條形碼用于高通量神經解剖學的第一個例子。”

　　快速地映射連接

　　弄清神經元是如何連接的，是理解大腦如何運作的一個重要組成部分。Kebschull說：“如果你認為大腦就像一臺計算機，我們就需要知道什么與什么連接在了一起，比如硬盤是否連接到了處理器。”

　　在目前的許多腦成像技術中，研究人員都是在神經元中表達一種熒光標記，并用顯微鏡觀察哪些大腦區域發光。但是Kebschull說：“每一個腦區有數千個神經元。”這些“批量跟蹤”方法不能區分單個神經元，因此，研究人員無法區分兩個源神經元最終到了同一區域，還是不同的區域。這是重要的信息。“不同的神經元可能具有不同的屬性，并可能攜帶不同的信息。”

　　其他的腦成像技術可以跟蹤單個神經元，但這些方法都是勞動密集型的和費時的。Kebschull說：“跟蹤一個單一的神經元需要數周的時間。如果你想研究成千上萬個神經元，你基本上完蛋了。”相反，MAPseq用了一個星期的時間，就繪制出了一個注射腦區的幾千個神經元圖，速度發生了一千倍的提升。

　　適應現有的工具

　　Zador和他團隊的靈感來自以前的腦成像技術，如Brainbow，研究人員隨機表達熒光標記物來標記不同的神經元，具有各種各樣多種的顏色（2）。但使用顯微鏡能夠容易區分的顏色數量有限，出于實際的目的，研究人員在這些模型中一次可以至多跟蹤10個神經元。

　　Kebschull說：“有了MapSeq，我們考慮從顏色切換到隨機核酸序列。”利用核酸條碼序列，將提供更多樣化的標志物，使用目前的高通量測序方法，這些可能是非常快速和相對便宜的讀數。從30個核酸序列的一段序列開始，研究人員將最終獲得1018個可能的序列，是小鼠大腦中神經元數量的10個數量級以上。

　　在2012年，Zador首次建議使用條碼測序用于高通量的大腦映射，那么，研究人員必須弄清技術細節（3）。他們決定使用一種無效的Sindbis病毒——在神經科學中常用的一種工具，來將條碼RNA序列運送到小鼠的神經元中。但他們馬上遇見了一種并發癥。

　　Kebschull說：“人們認為是非復制型的病毒，其實是復制型的。”因此，病毒粒子傳播超越了初級感染的神經元，來標記其他神經元，這將使得映射分析變得復雜化。對于新技術，Kebschull制備了一種重組Sindbis病毒，能感染神經元，但不傳播，為進一步改進鋪平了道路（4）。

　　一旦RNA條碼進入神經元，研究人員必須確保它們沿軸突運輸到它們的終端。為此，他們添加了一種工程化的蛋白質，并表明它能有效地工作。此外，研究人員希望確保每個標記的神經元收到一個獨特的條碼，并且他們計算了必須注入多少病毒，才能實現這一目標。Kebschull和Zador也弄清了如何用高通量測序準確地識別條形碼（5）。

　　測試技術

　　Zador的團隊在小鼠大腦藍斑（LC）的一部分中測試了MAPseq，這個腦區是一種激素去甲腎上腺素的來源。去甲腎上腺素可調節警覺性和專注力，來自LC的神經元是否延伸整個皮質或只到達特定區域，尚不明確。Kebschull說：“LC是一個很好的測試案例。”

　　使用MAPseq，研究人員發現從LC神經元投射出許多各種各樣的圖案，一些神經元到達一個特定的靶標，其他神經元則伸展的更廣泛。因此，來自LC的去甲腎上腺素可以到達整個皮質，以及在特定區域有更嚴重的影響，這與以前的研究結果一致。

　　目前的研究只使用一種病毒注射到LC，Zador和他的團隊正在努力增加尋找其他病毒。最終，他們希望利用MAPseq同時跟蹤整個皮層的神經元。Kebschull說：“我們正在擴大這種方法，以開展更多的高通量神經解剖學。”研究人員還計劃在不同疾病的小鼠模型中使用MAPseq。“我們可以研究不同的自閉癥或發育疾病小鼠模型，以探析大腦的連接是如何錯誤的。”