甲基化特異性PCR——亞硫酸氫鈉法

MSP是一種簡便、特異的、敏感的檢測單基因甲基化的方式。其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因 組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對特異性的引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結果。

DNA

亞硫酸氫鈉氫醌石蠟油乙醇

水浴鍋PCR儀

1.  在50 ul 體系中，DNA（2~5 ug）經NaOH（終濃度值0.2 mol/L）在37℃變性10 Min。

2.  對于ng級別的人基因組DNA，在進行修飾前加入2 ug蛙魚精DNA為載體。

3.  加入30 ul 剛配制好的10 mmo/L 氫醌與520/1的40.5%亞硫酸氫鈉混勻。

4.  然后用石蠟油隔絕空氣的條件下，避光在50%溫育16 h。

5.  修飾后的DNA過WizerdDNA純化柱，用50/1 L 水洗脫。

6.  室溫下用NaOH（終濃度為0.3 mol/L）修飾5 min，之后用乙醇沉淀。

7.  DNA溶于20 ul 水中，立即使用或在-20℃保存。

1. 3M亞硫酸氫鈉(pH5.0)和10mM對苯二酚需要臨用前新鮮配制。

2. Bisulfate處理后的DNA樣本易降解，應盡快使用，盡量減少反復凍融，使用時樣品保持在冰上，使用后剩余樣品盡快放回至-20℃凍存；若較長期保存應放置在-80℃。

3. 每次PCR反應都應設置甲基化陽性對照(IVD)和非處理樣品對照(非甲基化陽性對照)。

4. 不同基因和不同樣本的MS—PCR反應參數往往不相同，尤其是退火溫度和反應循環數等，有時需要通過反復的預實驗確定最佳反應參數。

1.引物因素分析MSP的引物設計的質量是擴增成敗的關鍵性因素。MSP的引物設計與普通的PCR引物設計不同，MSP的引物設計原理是：模板DNA在經過亞硫酸鹽處理后，發生甲基化的基因啟動子區域CpG島內CpG位點5 一端胞嘧啶保持不變；而未發生甲基化的CpG島內CpG位點5 一端胞嘧啶轉化為尿嘧啶，即C—U。針對修飾前后的序列差異用MethPrimer軟件設計甲基化與未甲基引物，進行PCR擴增。MSP的引物序列中至少含有1個以上CpG位點，最好是含有多個CpG位點，這樣可保證引物的特異性，同時可以提高DNA啟動子甲基化堿基的檢出率。MSP的引物必須按亞硫酸氫鈉處理后的DNA序列設計，同時也應該盡可能與普通PCR的引物設計原則相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP擴增時，至少要合成2對引物，即甲基化引物與未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前導引物不含鳥嘌呤堿基，反向引物不含胞嘧啶堿基。初涉及MSP者最好用文獻引物進行研究。如果是為了篩選新的甲基化的抑癌基因而文獻中無法找到的相應MSP引物，可用在線MethPrimer軟件在線設計引物，網址為http：／／www.urogene.org／methprimer／index1.html。根據軟件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困難是，要擴增的是啟動子或部分第一外顯子序列，其CG含量相對較高，MSP擴增難度加大，因此設計好的引物最好用引物軟件如Primer5.0從理論上推測其擴增效率，對于擴增效率<30％ 的引物要進行優化，方法是：在核心啟動子區域前后反復調整甲基化前導引物擴增起始點，以期使引物擴增效率增高，降低擴增難度，從而提高PCR產量。

2.MSP的反應體系問題MSP的反應體系的成分與普通PCR一樣，反應體系的優化也與普通類似，反應體系的優化與普通PCR的反應體系中最大的區別是DNA模板不同。經過修飾后的模板為單鏈狀態，MSP的DNA模板在抽提后應檢測其純度和含量，其純度要求A260／A280在1.8——2.0之間；其含量要準確檢測，否則在亞硫酸鹽處理時因DNA模板加的太多而導致DNA處理不完全而導致MSP擴增失敗；而加的DNA模板太少則一方面浪費試劑，另一方面會因為目的片段太少導致MSP假陰性。Mg“濃度一般在2.0——2.5 mmoL／L為宜，過低過高都不利于擴增。此外，PCR的緩沖液及Taq酶的來源也很重要，一般的PCR緩沖液常常會導致結果不穩定，不同來源的Taq酶也會影響結果的重復性。我們建議用Taka—ra公司針對富含CG等復雜二級結構模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果較好。而一旦選用某一廠家Taq酶后，不要輕易更換，以免MSP因重新優化而引起的時間和成本的浪費。

3.MSP的反應溫度分析MSP擴增的結果有3種情況：（1）產物電泳為陰性；（2）產物電泳出現多條非特異性條帶（含目的基因條帶）；（3）產物電泳為陽性（僅目的基因條帶）。出現前2種情況時，可在保證反應體系和引物沒有問題的情況下，通過調整MSP的反應溫度而得到目的基因帶。方法如下：PCR反應中，Tm的高低與CG含量呈正相關。因甲基化與未甲基化引物序列差異，在擴增過程中可能會出現PCR偏性。我們建議，提高預變性溫度（一般應>95℃，10 rain）和變性溫度（>95℃ ，1 min），退火溫度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。