電子顯微鏡使用實驗（二）

其他

一、電子顯微鏡與光學顯微鏡的主要區別

顯微鏡的分辨率取決于所用光的波長，1933年開始出現的電子顯微鏡正是由于使用了波長比可見光短得多的電子束作為光源頭，使其所能達到的分辨率較光學顯微鏡大大提高，而光源的不同，也決定了電子顯微鏡與光學顯微鏡的一系列差異。

圖1 電子顯微鏡與光學顯微鏡的區別

根據電子束作用于樣品的方式的不同及成像原理的差異，現代電子顯微鏡已發展形成了許多種類型。目前最常用的是透射電子顯微鏡（transmission electron microscope）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope），前者總放大倍數可在1 000~1 000 000倍范圍內變化，后者總放大倍數可在20~3 000 000倍之間變化，本實驗主要介紹這兩種顯微鏡樣品的制備。

實驗方法原理 掃描電鏡觀察時要求樣品必需干燥，并且表面能夠導電。因此，在進行掃描電鏡生物樣品制備時一般都需采用固定，脫水，干燥及表面鍍金等處理步驟。

實驗材料 大腸桿菌

試劑、試劑盒 二氧化碳戊二醛磷酸緩沖液乙醇

儀器、耗材 真空鍍膜機掃描電子顯微鏡臨界點干燥器冰箱蓋玻片載玻片

實驗步驟

一、固定及脫水

生物樣品的精細結構易遭破壞，因此在進行制樣處理和進行電鏡觀察前必需進行固定，以使其能最大限度地保持其生活時的形態。而釆用水溶性、低表面張力的有機溶液如乙醇等對樣品進行梯度脫水，也是為了在對樣品進行干燥處理時盡量減少由表面張力引起的其自然形態的變化。

將處理好的，干凈的蓋玻片，切割成4-6 mm2的小塊，將待檢的較濃的大腸桿菌懸浮液滴加其上，或將菌苔直接涂上，也可用蓋玻片小塊粘貼菌落表面，自然干燥后置光學顯微鏡鏡檢，以菌體較密，但又不堆在一起為宜；標記蓋玻片小塊有樣品的一面；將上述樣品置于1%~2%戊二醛磷酸緩沖液（pH7.2左右）中，于4℃冰箱中固定過夜。次日以0.15%的同一緩沖溶液沖洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分別依次脫水，每次15 min。脫水后用醋酸戊脂置換乙醇。

另一種與之類似的樣品制備方法是采用離心洗滌的手段將菌體依次固定及脫水，最后涂布到玻片上，其優點是

①在固定及脫水過程中可完全避免菌體與空氣接觸，從而可最大程度地減少因自然干燥而引起的菌體變形；

②可保證最后制成的樣品中有足夠的菌體濃度，因為涂在玻片上的菌體在固定及干燥過程中有時會從玻片上脫落；

③確保玻片上有樣品的一面不會弄錯。

二、干燥

將上述制備的祥品置于臨界點干燥器中，浸泡于液態二氧化碳中，加熱到臨界點溫度（31.4℃，72.8個大氣壓）以上，使之氣化進行干燥。

樣品經脫水后，有機溶劑排擠了水分，擠占了原來水的位置。水是脫掉了，但樣品還是浸潤在溶劑中，還必需在表面張力盡可能小的情況下將這些溶劑請出去。使樣品真正得到干燥。目前采用最多，效果最好的方法是臨界點干燥法。

其原理是在一裝有溶液的密閉容器中，隨著溫度的升高，蒸發速率加快，氣相密度增加，液相密度下降。當溫度增加到某一定值時，氣、液二相密度相等，界面消失，表面張力也就不存在了。此時的溫度及壓力即稱為臨界點。將生物樣品用臨界點較低的物質置換出內部的脫水劑進行干燥，可以完全消除表面張力對樣品結構的破壞。目前用得最多的置換劑是二氧化碳。由于二氧化碳與乙醇的互溶性不好，因此樣品經乙酵分級脫 水后還需用與這兩種物質都能互溶的媒介液醋酸戊脂置換乙醇。

三、噴鍍及觀察

將樣品放在真空鍍膜機內，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡中進行觀察。