實驗概要
本實驗介紹了病毒感染力的滴定（TCID50的測定）。有助于了解病毒感染力測定的幾種常用方法，掌握半數細胞培養物感染量TCID50的操作步驟、計算方法及含義。
實驗原理
半數致死量LD50( 50% lethal dose)：用動物或雞胚來檢測
半數雞胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測
半數細胞培養物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用細胞來檢測
蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細胞來檢測
主要試劑
1. 胰酶
2. 生長液
3. 病毒液（PRV）
主要設備
1. 吸球、吸管
2. 96孔細胞培養板
3. 加樣器、槍頭
實驗材料
長滿單層的細胞1瓶
實驗步驟
1. 在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續10倍的稀釋，從10-1-10-10。
2. 將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100μl。
3. 在每孔加入細胞懸液100μl，使細胞量達到2~3×105個/ml。
4. 設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。（100μl生長液 100μl細胞懸液）
5. 逐日觀察并記錄結果，一般需要觀察5-7天。
6. 結果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法
7. TCID50的計算方法
1) Reed-Muench兩氏法
病毒液稀釋度 | 出現CPE孔數 | 無CPE孔數 | 累計 | 出現CPE孔所占的% | |
CPE孔數 | 無CPE孔數 | ||||
10-1 | 8 | 0 | 27 | 0 | 100（27/27） |
10-2 | 8 | 0 | 19 | 0 | 100（19/19） |
10-3 | 7 | 1 | 11 | 1 | 91.6 （11/12） |
10-4 | 3 | 5 | 4 | 6 | 40（4/10） |
10-5 | 1 | 7 | 1 | 13 | 0.7（1/14） |
10-6 | 0 | 8 | 0 | 21 | 0（0/21） |
CPE：Cytopathic effect
距離比例＝（高于50%病變率的百分數-50%）/（高于50%病變率的百分數-低于50%病變率的百分數）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
lgTCID50=距離比例×稀釋度對數之間的差 高于50%病變率的稀釋度的對數
=0.8×(-1) (-3)
=-3.8
TCID50=10-3.8/0.1ml
含義：將該病毒稀釋103.8接種100μl可使50%的細胞發生病變。
2) Karber法
病毒液稀釋度 | 出現CPE的孔數 | 出現CPE孔的比率 |
10-1 | 8 | 8/8=1 |
10-2 | 8 | 8/8=1 |
10-3 | 7 | 7/8=0.875 |
10-4 | 3 | 3/8=0.375 |
10-5 | 1 | 1/8=0.125 |
10-6 | 0 | 0/8=0 |
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L：最高稀釋度的對數
D：稀釋度對數之間的差
S：陽性孔比率總和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
含義：將該病毒稀釋103.875接種100μl可使50%的細胞發生病變。