實驗步驟
將所有的試劑成分和樣品都平衡至室溫。實驗前反復倒置以混合試劑和樣品。
試劑準備：
1）1X洗滌液的配制：用生物學或高純度水將10倍濃縮型的洗滌液稀釋成1X的洗滌液。為了制備即用型的洗滌緩沖液，我們可以將120ml 10倍濃縮的洗滌液加入到1080ml蒸餾水或去離子水中，沖洗掉所有晶體，旋渦混合溶液以至所有晶體都溶解掉。制備好的洗滌液可在室溫下穩定儲存6個月。使用前請檢查洗滌液是否被污染。
2）包被板的準備：將實驗所需數目的板條置于板架上。將剩余的板條立即裝入包裝袋中，并儲存于2-8℃的環境下，有效期內穩定。
操作步驟：
1）陽性質控、陰性質控都必須做雙份檢測,DENRA和NCA都要檢測，未知血清樣品可做一份或雙份，DENRA和NCA都要檢測，按照說明書上的操作流程圖進行操作。
2）將實驗中使用的板條標記好。
3）用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質控品稀釋100倍。用小聚丙烯試管進行稀釋，稀釋時至少需要4ul血清、陽性質控和陰性質控。如：4ul血清加396ul稀釋液。
4）用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質控和陽性質控各50ul加入到相應的微孔中。注意，所有的樣品都必須用DENRA和NCA檢測。
5）用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。
注意：這樣是為了保證溫度的分布在每個孔的底部和邊緣同等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發，任何多余的封板膠必需被剪掉。
6）37℃下孵育1小時。注意：不要將微孔板疊放，必須單獨地分層平輔。這對于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體，不要讓板條接觸任何濕潤的物質，如濕紙巾等。
7）溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。
9）用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）
10） 37℃下孵育1小時。（同步驟6）
11） 溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
12） 用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標記的酶聯物。
13） 用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）
14） 37℃下孵育1小時。（同步驟6）
15） 溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
16） 用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。
17） 室溫下溫育（無需蓋板）5min。
18） 溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
19） 用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。
20） 室溫避光溫育10min。
21） 溫育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液，室溫溫育1min。
22） 溫育后，450nm處測 OD值。
登革熱IgM ELISA實驗操作流程圖：
羊抗人IgM包被的包被板 |
將1/100比例稀釋好的陰性質控、陽性質控和血清各50ul加入到相應的微孔中 |
在每一微孔中加入50ul 即用型的DENRA和NCA |
37℃下溫育1h，溫育后洗板6次,300ul/孔 |
在每一微孔中加入50ul HRP標記的酶聯物 |
37℃下溫育1h，溫育后洗板6次 |
37℃下溫育1h，溫育后洗板6次 |
在每一微孔中加入75ul TMB底物液 |
室溫避光溫育10min |
在每一微孔中加入50ul終止液 |
在每一微孔中加入150ul Enwash溶液，室溫溫育5min。之后用洗滌液洗板6次 |
酶標儀450nm處讀取OD值 |
室溫溫育1min