一、目的DNA片段和載體的制備
選擇適宜的限制性核酸內切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA,用于重組。根據目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當的限制酶切割，分別產生對稱性粘性末端（用一種限制性內切酶進行消化而產生帶有互補突出端）、不對稱粘性末端（用兩種不同的限制性內切酶進行消化而產生帶有非互補突出端）、平端。在亞克隆時，首選不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時目的片段的末端與載體不匹配 ,一般先將不匹配末端補平，然后再以平末端連接。
二、利用T4 DNA連接酶進行目的DNA片段和載體的體外連接
1.連接要求和結果
帶有相同末端（平端或粘端）的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質粒載體中，但是在連接反應時，外源DNA和質粒都可能發生環化，也有可能形成串聯寡聚物。因此，必須仔細調整連接反應中兩個DNA 的濃度，以便使“正確”連接產物的數量達到最佳水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA片段和載體的體外連接反應，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個新的磷酸二酯鍵;如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導入感受態細胞后可被修復。
2.T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案
1.連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。
2.10μl體積反應體系中：取載體50-100ng,加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1-1∶5），補足ddH2O 至8μl.
3.輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉入冰浴。
4.加入含ATP的10×Buffer 1μl,T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl,稍加離心，在適當溫度（一般14-16℃水浴）連接8-14hr.
三、連接產物的轉化
1.感受態細胞的制備
⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌種）用接種環劃菌于1.5%瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養至單菌落出現（約14-16 hr）。
⑵ 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養基中，37℃恒溫，250g振蕩培養過夜（約12hr）。
⑶ 取0.5ml 過夜培養液，接種于100ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養2-2.5hr,至OD600為0.4-0.5時，放置于4℃冰箱冷卻1-2hr.
（注：以下操作均應在冰浴中進行。）
⑷ 將培養液分入兩個50ml離心管中，4℃離心，4000g×10min,棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30min.
⑸ 4℃離心，4000g×10min,棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。
⑹ 以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存備用。
注：此法制備感受態細胞，可使每微克超螺旋質粒DNA產生5×106-2×107個菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規克隆的需要，制備的感受態細胞可貯存于-70℃，但保存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響，一般三個月以內轉化效率無多大改變。
2. 連接產物的轉化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開;
⑵ 加入適量連接產物（一般不超過10μl,輕輕混勻，冰浴20min;
⑶ 于42℃熱休克90s,迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-3min;
⑷ 加入LB液體培養基200μl,于37℃緩搖孵育45min;
⑸ 將培養物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據質粒性質添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養12-16hr.
四、重組子的篩選
根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。 收起 | 