相對RTPCR:樣品定量實驗

試劑、試劑盒 雙蒸水RT-PCR 緩沖液MMLV 逆轉錄酶SUPERaseINRNA 酶抑制劑 Taq DNA 聚合酶總 RNA 隨機引物dNTP 混合物 基因特異的正向引物基因特異的反向引物[a-32P]dCTP

儀器、耗材 Quantu mRNA Universal 18S standards PCR 管 PCR 儀

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

去除 RNA 酶的雙蒸水

10XRT-PCR 緩沖液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKCl,15 mmol/LMgCl2)

2. 酶和酶緩沖液

MMLV 逆轉錄酶（100-200U/ul)

SUPERaseINRNA 酶抑制劑（20U/ul;Ambion)

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)

3. 核酸和寡核苷酸

總 RNA(每個樣品達到 2.5ug)

隨機引物（50umol/L)

dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)

基因特異的正向引物（5umol/L)

基因特異的反向引物（5umol/L)

4. 放射性復合物

[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)

5. 實驗器材

Quantu mRNA Universal 18S standards (Ambion; 包括 18S PCR 引物對和 18S PCR 競爭子）

薄壁的 PCR 管

專用儀器

可編程的 PCR 儀

二、方法

1. 如方案 1 所述，集中運行單鏈 cDNA 合成反應，決定所有犇品的線性范圍時使用同樣量的 RNA。

2. 在冰上準備 PCR 反應混合物。

10XRT-PCR 緩沖液                                           50ul

10 mmol/LdNTP 混合物                                     40ul

5umol/L 基因特異的正向引物                             20ul

5umol/L 基因特異的反向引物                             20ul

18S rRNA 引物和競爭子（以方案 2 決定的比例添加）       40ul

5U/ulTaq DNA 聚合酶 rk;                                    2.5ul

[a-32P]dCTP(10uCi/Hl)                                       5ul

去除 RNA 酶的雙蒸水                                    312.5ul

3. 在 9 個薄壁 PCR 管中分別添加 49ul 的 PCR 反應混合物。

4. 加 1ulddH20 于不加模板的對照管中。

5. 加1ul 每種樣品 RNA 到相應的非反轉錄對照管中。

6. 加 1ul 從第一步 cDNA 合成反應中得到的每種樣品的 cDNA 到相應的管中。

7. 做 PCR, 如方案 1 所述，使用擴增線性范圍決定的最佳循環數。

8. 如方案 1 所述，用變性凝肢電泳來分析實驗結果。不加模板的對照和非反轉錄對照應沒有 PCR 產物產生。定置樣品 PCR 產物的相對含量，可以用基因特異性產物的信號除以 18S rRNA 的信號，從而可以得到每個樣品中基因特異產物的準確相對值，這些值可以用來比較樣品間模板 RNA 的相對表達量。用樣品 1 的標準化信號/樣品 2 的標準化信號可以得到一個比值，以倍數或百分比表示。相對定量 RT-PCR 的實例見圖 13-4。