現今，科技發展的齒輪正在高速運轉，每隔2-3年就會出現一個重大的技術變革引領生命科學走向更精細、更微觀、更真實的水平，這其中也包括蛋白的研究。在疾病的致病機理、分子機制、信號通路、藥物篩選以及新型診斷標志物的發現中，傳統的蛋白研究“金標準”方法如Co-IP、Western blot、ELISA、IF等已呈現出很大的局限性。
你可能在實驗中遇到過以下問題：
WB方法靈敏度較低，無法檢測低豐度、瞬時表達的蛋白；
Co-IP方法無法檢測蛋白之間的微弱相互作用及間接相互作用；
蛋白過表達或融合標簽后會改變其原有的功能，造成假陽性等結果；
非內源性表達，無法反應真實的狀態，結果無說服力；
……
這表示，你目前使用的蛋白檢測方法已無法滿足研究所需的技術要求，是時候跟上蛋白研究技術變革的腳步，找到合適的新方法！看得見的蛋白互作新技術Duolink? PLA? 加速了蛋白研究新發現。該技術可將蛋白信號放大1000倍，實現單分子級別的靈敏度。即便是微量樣本、微弱互作、極罕見的低豐度表達，也能在內源水平可視化研究蛋白的互作、定位和定量。更關鍵的是該技術操作簡單，僅需一天！
Duolink? PLA? 技術至今已在腫瘤學、神經生物學、免疫學、病毒學、表觀遺傳學、生殖發育、組織病理學、心血管、代謝等研究領域進行了廣泛報道。下面針對不同方面的應用實例進行簡單分享。
應用1：蛋白瞬時相互作用檢測，解決Co-IP技術無法實現的應用
在腫瘤學研究過程中，很多蛋白的相互作用過程并不是穩定的，而是動態變化和瞬時產生的，下圖是一篇腫瘤血管生成的研究，顯示VEGF刺激前后的不同時間，Duolink PLA技術能夠原位檢測內皮細胞中VE-PTP與VEGFR2復合物的相互作用，每一個紅點代表一個相互作用的復合物，藍色代表細胞核。作者通過PLA技術發現VEGF以瞬時作用方式調控VE-PTP和VEGFR2復合物的形成，文章顯示用傳統的Co-IP方法無法檢測VE-PTP與VEGFR2的相互作用。此外，由于PLA是細胞內源性水平檢測，因此這種相互作用結果更加真實，作者也通過PLA技術發現了VE-PTP在血管生成中具有重要的功能。
應用2：微量細胞中的微弱蛋白互作檢測，解決Co-IP技術無法實現的應用
在神經生物學研究中，很多時候研究的起始材料包括細胞、組織等非常微量，同時相互作用的蛋白也很微弱，超出了傳統方法如CO-IP的檢測靈敏度。DYX1C1是閱讀障礙的易感基因，與神經元遷移有關，但并不清楚他們之間的功能與相關性。下圖顯示原代大鼠胚胎海馬神經元使用雌二醇培養48h，PLA檢測雌激素受體ERs/DYX1C1在神經突觸中的相互作用（A，D為雌二醇（E2）刺激組，B,E 為未刺激組，C，F為無抗體陰性對照），每一個紅點代表 ERs/DYX1C1相互作用的復合物，藍色代表 Hoechst 染細胞核，綠色代表Actin蛋白。作者使用傳統Co-IP方法并沒有在胚胎神經元中檢測到相互作用的復合物。通過PLA技術，對DYX1C1的功能有新的理解，發現了神經元遷移、閱讀障礙與雌性激素信號通路的聯系，從而影響腦發育，調節認知功能。
應用3：病理組織中蛋白相互作用的原位檢測，解決IHC無法實現的應用
在腫瘤的靶向治療過程中，BRAF是非常重要的藥物靶點，很多腫瘤都存在BRAF(V600)的突變，很多藥物都是針對這個位點，但是逐漸增加的藥物抗性讓大家迫切希望能夠進一步發現新的藥物靶標，和傳統藥物聯合治療，進一步提高藥物治療效果。下圖是發表在Nature上的文章，從藥物產生抗性的機理出發，針對抗性相關的信號通路中共同的復合物eIF4F，開發了PLA原位技術在細胞以及臨床的病人病理組織樣本進行大量的檢測。下圖顯示與anti-BRAF治療前的腫瘤相比，eIF4F復合物的形成比率在免疫應答的腫瘤中降低，在抗藥性轉移的腫瘤中復合物形成比率升高，圖中每個棕色的點狀信號代表一個相互作用復合體。因此eIF4F 能夠作為先天（innate）和獲得性（acquired）抗性的指示器，也能作為抗腫瘤治療的靶標，通過封閉eIF4E–eIF4G相互作用或靶向 eIF4A，能夠抑制eIF4F復合物的形成，從而協同抑制BRAF(V600)，消除腫瘤細胞。PLA技術作為病理組織學研究的第二代新技術，在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精確性，是傳統IHC實驗無法實現的，能夠建立高質量的病樣組織標本庫。
應用4．可視化檢測蛋白相互作用與翻譯后修飾，解決IF技術無法實現的應用
在很多相互作用和蛋白修飾的研究中，我們不僅希望發現兩種蛋白的相互作用或是蛋白的翻譯后修飾，我們更希望能夠觀察到這種相互作用，對這種相互作用準確定量。下圖文章是將PLA技術與流式技術結合，通過蛋白之間的相互作用及翻譯后修飾研究，為腫瘤提供新的預后標志物。下圖顯示PLA技術結合流式，能夠在不同類型細胞中對EGFR與HER2 的同源和異源二聚體的相互作用進行定量檢測，然而IF與流式結合無法對二聚體進行準確定量。此外，細胞在EGF刺激后，二聚化模式和磷酸化狀態發生了變化，EGFR和HER2在不同細胞系有很大不同，PLA能夠對EGFR的激活進行可視化研究，但IF無法觀察到EGFR的激活，圖中紅色為PLA檢測的磷酸化的 EGFR 蛋白。因此PLA技術與FCM的結合能在單細胞水平為蛋白相互作用和翻譯后修飾提供更為強大的方法，能夠為惡性腫瘤的治療提供預后靶標。
應用5．單細胞水平檢測組蛋白的修飾進行分析，解決ChIP研究中無法實現結果的應用
表觀遺傳學是當前一大研究熱點，而ChIP又是表觀遺傳學中最重要的技術之一，它能幫助研究者很好地理解組蛋白修飾在基因調控中的作用，但ChIP無法應用于單細胞水平。下圖這篇發表在Nature上的文章，將PLA技術與原位雜交（ISH）技術聯合起來開發出新的ISH-PLA技術，可在石蠟切片的組織樣本中，對特定類型單細胞中的特定基因位點的組蛋白修飾進行可視化研究。圖中箭頭表示在人頸動脈和腦組織中的組蛋白修飾的PLA信號。研究發現在人和小鼠的組織中MYH11位點的H3K4me2被限制在平滑肌細胞中，ISH-PLA 能準確、特異性地檢測人和小鼠組織中單個細胞的特定基因位點的組蛋白修飾。該研究第一次在復雜的多種類型細胞存在的完整組織樣本中，在內源性水平鑒定了特定細胞和基因位點的組蛋白修飾，顯示在體內SMC細胞中MYH11基因H3K4me2獨特和重要的表觀特征，表明PLA技術可以很方便地適用于單細胞水平組蛋白修飾和多個基因位點的檢測。
應用6．高通量蛋白互作檢測，藥物篩選和靶標驗證新方法
藥物研發過程中很大的一個障礙是很多臨床前篩選的藥物由于在臨床使用中達不到預期效果或由于嚴重的副作用導致藥物無法獲得批準，占據了很高的研發費用。雖然高通量的化合物篩選能顯著提高藥物的篩選能力，但并沒有獲得很高的開發成功率。因此，急需一種方法能夠鑒定生物學相關復合物，在藥物研發早期能更精確地預測體內效應。
下圖文章基于藥物在信號通路中的效應開發了高通量的PLA篩選技術，通過前期鑒定的激酶抑制劑文庫進行高通量篩選。通過對 PLA技術篩選在激活的原代人成纖維細胞中能夠抑制PDGF受體信號通路的復合物，在80個復合物文庫中發現13個能夠作為潛在候選（hits），這些復合物的劑量效應檢測顯示具有很高的Z’ factor(0.71)和信噪比(11.7)，具有很高的抑制特定信號通路的能力。與磷酸化PDGF受體的免疫熒光(IF)檢測進行比較，顯示出PLA對受體磷酸化抑制效果的檢測具有更高的檢測效率。PLA藥物高通量的細胞內原位檢測，能對抑制劑誘導的PDGF信號通路中蛋白相互作用進行準確定量，結果更真實，篩選效率更高。