碘克沙醇及Ficoll400分離純化大鼠胰島細胞的效果對比

實驗概要

本實驗的目的是分別使用碘克沙醇和Ficoll-400密度梯度液純化大鼠胰島細胞，?比較兩者分離純化大鼠胰島細胞的收獲量、純度、活性和功能。主要方法為將20只SD大鼠隨機分為碘克沙醇純化組和Ficoll-400純化組，以膠原酶P消化分離SD大鼠胰腺，分別采用碘克沙醇及Ficoll-400密度梯度液來純化胰島細胞。通過DTZ染色，計數胰島細胞的數量和純度，用胰島素釋放試驗和胰島移植評估胰島細胞的功能。

主要試劑

膠原酶P溶液(Roche公司)，碘克沙醇工作液 (EZ-SepTM，達科為公司產品)，HCA液(上海長征醫院產品)，RMPI1640培養液(Gibco公司)，新生小牛血清(杭州四季青公司)。

主要設備

冷凍離心機(上海安亭)，電子密度計(梅特勒公司)。

實驗材料

♂SD大鼠，體質量200-250 g。20只SD大鼠隨機均分為2組：碘克沙醇組及Ficoll-400組；兩組分別使用碘克沙醇-HCA或Ficoll-400-HCA作為密度梯度液來分離純化胰島細胞。

實驗步驟

1. 胰島細胞的分離純化

SD大鼠通過戊巴比妥鈉[按30  mg/(kg·w)]腹腔內注射麻醉，取腹壁正中切口打開腹腔，將4℃ 0.5 g/L的膠原酶P溶液(Roche公司)約8-10  mL緩慢經膽總管逆行注入胰管內，使胰腺充分膨脹，迅速摘取完整胰腺，置入預溫至帶有小玻璃珠的38℃  Hanks液小瓶中，在38℃水浴鍋中靜止消化約10-12 min后，輕柔振蕩1-2  min或以玻璃吸管輕柔吹打胰腺使胰腺組織均勻分散呈泥沙狀，將胰腺消化物懸液以40目不銹鋼篩網過濾以去除淋巴結、導管及血管等組織，然后迅速加入裝有40  mL 4℃含200 mL/L小牛血清的RMPI1640培養液(Gibco公司)的離心管中，低速(800 r/min)離心洗滌2次。
2. 胰腺消化物的孵育

將上述所得之胰腺消化物按1∶3比例加入4℃含200   mL/L小牛血清的HCA器官保存液混勻，取樣分別行雙硫腙(DTZ)及碘化丙啶/亞啶橙(PI/AO)染色計算純化前胰島細胞團的產量及活率。將胰腺組織孵育液置0-4℃冰浴中孵育10  min，每隔2 min對孵育液進行輕微振蕩以免胰腺消化物黏結。
3. 胰島純化

   1) 碘克沙醇組：將10  mL孵育好的胰腺消化物懸液離心去上清后與5  mL碘克沙醇工作液[EZ-SepTM，自行用電子密度計以HCA液(上海長征醫院產品)調整其密度為1075 g/L，滲透壓280±15  mOsm/L，達科為公司產品]充分混勻后加入含1090 g/L碘克沙醇-HCA液10  mL的推進式離心管中，置4℃立式冷凍離心機，設置離心力為500 g，離心5 min; 收集兩層密度梯度液之間懸浮的細胞層；

   2) Ficoll-400組：將10  mL孵育好的胰腺消化物懸液離心去上清后，與5 mL 200 g/L的Ficoll-400-HCA液(Sigma)充分混勻后，加入含10 mL  250 g/L Ficoll-400-HCA密度梯度液的推進式離心管中，置4℃立式冷凍離心機500 g，離心5  min；用活塞推出20%與25%層面交界部位的細胞層; 兩組收集的細胞均以4℃含100 mL/L小牛血清的RMPI1640培養液1200  r/min離心洗滌2遍，純化胰島細胞取樣鑒定。
4. 胰島細胞鑒定

收集純化胰島細胞，取樣行DTZ染色后解剖鏡下計數并觀察純化后胰島細胞團的形態，計算得率[胰島細胞團數量以胰島細胞當量來計算(IEQ)]及純度(純度 = DTZ染色陽性的胰島個數/細胞團總數).
5. 純化后胰島細胞的活力測定

將胰島制備物與碘化丙啶/亞啶橙儲備液混合10 min，在熒光顯微鏡下用490 nm激發光濾光片，510 nm光柵濾光片觀察。胰島活細胞發出綠色熒光，死細胞發出紅色熒光。胰島細胞活率用胰島活細胞占所有胰島細胞總數的百分比表示。
6. 胰島分泌功能的測定

分別從兩組手工挑取50個直徑在150-200 μm之間的胰島細胞，加入含100 mL/L胎牛血清、10 mmol/L HEPES、3.3 mmol/L葡萄糖的RMPI1640培養液2 mL中，置于34℃，50 mL/L CO₂的培養箱中6  h，留取上清液標本后，棄去所有上清液；再加入2 mL含16.7 mmol/L葡萄糖的RMPI1640培養液，繼續培養6  h，分別檢測兩者培養液上清的胰島素含量，胰島素測定采用間接放射免疫法(放射免疫測量藥盒大鼠胰島素放免試劑盒，美國Linco公司)。
7.  大鼠糖尿病模型的制備隨機選取Wistar大鼠，分籠飼養，禁食過夜，測定空腹血糖。用檸檬酸緩沖液(pH4.2-4.6)配制10  g/L的鏈脲佐菌素(STZ)，由陰莖背靜脈注入[按60 mg/(kg·w)]。連續觀察空腹血糖變化，血糖濃度每3  d測定1次，連續兩次高于16.8 mmol/L者定為糖尿病模型。
8. 大鼠胰島細胞移植

與供體胰島相對應將Wistar糖尿病成模大鼠隨機分為碘克沙醇組和Ficoll-400組以及對照組，每組5只，在碘克沙醇組和Ficoll-400組的糖尿病成模大鼠的雙側腎包囊中植入純化后的SD大鼠胰島細胞團1000個IEQ，對照組糖尿病大鼠腎包囊內注射1  mL Hanks液。移植后每隔1 d測血糖、尿糖1次，非空腹血糖連續低于11.2  mmol/L及尿糖陰性，作為移植物功能存活的標準；否則作為移植物受排斥、功能喪失的指標。
 9. 統計學處理

應用SPSS10.0軟件進行統計分析，數據以mean±SD表示，具體統計方法采用配對t檢驗(Paired-Samples T Test)方法。