在糖解作用中，此分子是2-磷酸甘油酸在烯醇化酶（enolase）的催化下生成，是一個高能磷酸分子。接下來磷酸烯醇丙酮酸將會進入糖解作用的第10個，也是最后一個步驟中。
在糖解作用的最后步驟里，磷酸烯醇丙酮酸將會經由丙酮酸激酶（Pyruvate kinase）的催化，使原本接在氧原子上的磷酸根轉移到ADP上，進而生成ATP以及丙酮酸。這個反應會放出大量的能量，是一個難逆的反應，其標準自由能變化是31.4 kJ/mol（在pH=7、濃度55.5M的水中）。此外，這個反應也需要鉀離子與鎂離子（或其他二價陽離子）的參與。