結果顯示，從 DIA 數據中提取、定量到 6401 條可信的磷酸化肽，占譜圖庫磷酸化肽總數（6505 條）的 98.4%（圖 5）。磷酸化肽的豐度和離子化效率普遍較低，本實驗如此高的解析成功率表明，基于 Orbitrap 的 DIA 數據具有極高的譜圖質量和出色的靈敏度。
圖5. DIA可靠解析的磷酸化肽占譜圖庫總數的98.4%
進一步對 6401 條磷酸化肽 XIC 色譜峰面積的三針重現性進行統計。將每條肽的母離子和子離子峰面積分別加和，選取兩者中重現性最好（即 CV 值最低）的結果用于定量。一般認為，峰面積 CV 值 < 20% 時定量結果可靠、準確。統計結果顯示，峰面積 CV 值 < 20% 的磷酸化肽占總數的 86.9%（圖 6）。如此高的重現性說明 Orbitrap DIA 不僅具有出色的靈敏度，同時具有優越的重現性，勝任復雜的翻譯后修飾定量。
圖 6. 磷酸化肽峰面積重現性（CV 值）統計
圖 7 展示了一個典型的磷酸化肽 DIA 解析結果。該磷酸化肽有 2 種異構體，分別在 3 號位和 9 號位的絲氨酸上發生了磷酸化。得益于高質量的 DIA 譜圖和嚴格的譜圖庫建立，即使這 2 種異構體保留時間非常接近，也能成功、準確地分辨。DIA 獲得的碎片豐度比與譜圖庫非常接近，匹配打分的 dotp 值均在 0.95 以上。
圖 7. 磷酸化肽異構體在 DIA 中的分辨和匹配打分（dotp）
結論
翻譯后修飾由于肽段上修飾位點的多重性和不確定性，難以獲得可靠的 DIA 結果，這一問題是 DIA 發展的瓶頸所在。另一方面，phosphoRS/ptmRS 和 MaxQuant 等算法和軟件的發展，使翻譯后修飾位點的 DDA 鑒定、定位更加準確。本文基于上述算法和軟件對磷酸化樣本的 DDA 鑒定結果進行位點打分，并篩選出位點定位準確、可靠的譜圖建立譜圖庫用于 DIA 分析，成功從磷酸化樣本 DIA 數據中提取 6401 條可靠的磷酸化肽（Q < 0.01），占譜圖庫中磷酸化肽總數的 98.4%。其中，86.9% 的肽段峰面積 CV < 20%，可用于精確的磷酸化定量。該策略有效解決了翻譯后修飾 DIA 定量的難題，證明基于 Orbitrap 超高分辨質譜技術的 DIA 流程兼具出色的靈敏度和優越的重現性，是復雜樣本定量特別是翻譯后修飾樣本定量的最佳選擇。
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