糖異生作用基本上可以看成是糖酵解的逆轉。但是，在糖酵解途徑中有三步反應是不可逆的，即由己糖激酶、磷酸果糖激酶，丙酮酸激酶催化的反應是不可逆的。然而這三步反應仍可以通過不同酶催化“逆轉”。
但反應過程并非原反應過程的逆向進行。下面以反應式來表示這種“逆轉”，實線為糖酵解過程，虛線為糖異生過程。
從上面反應看出，丙酮酸繞過不可逆的丙酮酸激酶經丙酮酸羧化酶催化形成草酰乙酸，再經PEP羧激酶催化生成PEP，從而實現糖酵解最后一個不可逆酶的繞過。
第二步是果糖-1，6-二磷酸酶催化果糖-1，6-二磷酸水解為果糖-6-磷酸。糖酵解的第一個不可逆反應由葡萄糖-6-磷酸酶催化G-6-P的“逆轉”，這樣最終實現了糖的異生。