糖蛋白糖基化

　　已上市的蛋白藥物中，治療性糖蛋白藥物數量眾多，糖基化是最常見的蛋白翻譯后修飾。2020版《中國藥典》第一增補版中，正式發布9405糖蛋白的糖基化分析指導原則。賽默飛能為糖基化分析提供業內最全方案，可根據糖蛋白的復雜性、與藥物安全有效的相關性以及生產監控策略的總體設計等，為糖基化提供完整糖蛋白、糖肽、寡糖、單糖的全面分析。

　　一級結構分析：糖型分析

　　糖基化對蛋白藥物的療效、穩定性、免疫原性具有重要的影響。以單克隆抗體為例，如果出現N-糖型以外的糖型，則會影響免疫原性或半衰期，需要避免；另一方面，可以細胞工程及分子生物學技術，提高一些N-糖型的含量，以增強ADCC、CDC、Anti-inflammatory等效能。寡糖為非模板合成，并呈樹狀結構，其結構極其復雜，僅由6種單糖組成的寡糖鏈，其理論結構即達到驚人的1012種。這就要求用于寡糖的分析設備具有強悍的分析性能。賽默飛開發了一系列簡單、高效的液相色譜-質譜表征方法，涵蓋了從糖鏈結構分析、到糖基化位點鑒定、再到糖肽解析的完整分析流程。

　　寡糖鏈分析

單克隆抗體N-糖鏈 (a) LC-MS/MS完整分析流程, (b) IC-MS分析流程

ED安培檢測器和MS檢測N-糖型結果

　　使用賽默飛Vanguish Horizon UHPLC-FLD對人血清lgG和商業嵌合lgG1單抗(英夫利西單抗)中的n-聚糖進行釋放、標記、分離和基于外糖苷酶的結構解析，并使用Q Exactive Plus超高分辨質譜儀對結構進行確認，實現快速和明確的分析。

在 Accucore 150-Amide-HILIC 上用不同長度的柱子對人血清 IgG 2-AB 標記的N-聚糖進行色譜分離

　　離子色譜無需衍生，定量準確，可以覆蓋分析所有糖類型，N-糖基化修飾的糖鏈可以通過肽糖苷酶Ｆ或肽糖苷酶Ａ酶切作用，或者肼解作用從糖蛋白上釋放出來。糖鏈經凈化后可直接進樣，無需衍生，避免了衍生化過程中唾液酸化聚糖的結構改變。

使用 Accucore 150-Amide-HILIC 色譜柱和 Q Exactive Plus 質譜儀對人 IgG 中 2-AB 標記的 N-聚糖進行結構鑒定

　　離子色譜還可以和高分辨質譜聯用，實現對色譜峰的鑒別。以Q Exactive為代表的Orbitrap超高分辨率質譜對未標記的糖具有高靈敏度，可解析糖鏈結構。安培檢測器、高分辨質譜和離子色譜聯用，可同時解決糖鏈的定性和定量分析。

Ofatumamab的N糖圖譜

　　糖基化位點分析

　　糖基化位點的發現與確證對質譜的分辨率與靈敏度具有較高要求。Orbitrap由于具有超高分辨率和超高靈敏度，無論對于單抗等純蛋白樣品、還是全細胞蛋白等復雜樣品，都是是糖基化位點表征的最佳工具。目前糖基化位點最大的數據集，共從小鼠組織與血漿中注釋了6367個糖基化位點。該實驗采用用PNGase F釋放糖鏈并標記18O方法，使用Orbitrap鑒定糖基化位點，共鑒定到6367個位13點，其中5753個位點是沒有記載的新位點。該研究對糖蛋白糖基化的研究具有重要意義，也展示出了Orbitrap超群的性能。在相對簡單的抗體及其他蛋白藥物糖基化位點表征中，Orbitrap 更可毫無疑問地勝任此工作。

　　對于糖結構和糖基化位點信息分析，Orbitrap Eclipse三合一質譜儀擁有CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多種碎裂模式，而且還具有高達50萬的分辨率，能夠對多種形式的修飾肽段進行精準定性與定量，為研究者提供了更堅實的硬件基礎。

新冠病毒S蛋白上符合“O-Follow-N”規律的O糖基化修飾