纖維蛋白原測定

纖維蛋白原是所有凝血因子中含量最高的一種凝血蛋白，其在血漿中的濃度可高達4g/L；其分子結構以及由纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的詳細化過程（包括纖維蛋白（原）經纖溶酶溶解生成FDP的過程）早已搞清。就是這樣一種蛋白，至今仍無理想的臨床常規檢測方法。文獻中查到和臨床實驗室正式使用過的檢測方法有數十種。這些方法有的精密度及準確性較好，但操作過于復雜、繁瑣，不適于常規應用；有的雖簡便、快速，但準確性及精密度都較差。現有的方法大體上分三大類：即（1）基于凝血酶的作用，形成纖維蛋白的方法；（2）物理化學測定法和（3）免疫學測定法。

　　第一類方法是一種功能測定法，所形成的纖維蛋白，又可再分為測重法，酚試劑比色法和紫外光度法、測氮法、濁度法和凝血酶凝固時間法等。這類方法的優點是測定的是有凝血功能的纖維蛋白原，又稱為可凝固蛋白（clottable protein），故特異性較好。方法可簡可繁，常規使用中，多采用較簡便的Von Clauss法。[17]根據這種方法設計的商品藥盒（kit），已在一些國家廣泛使用。據1975年美國CAP的調查，1939個臨床化驗室中，用此法者占1824家，即94%用了本法，其中Tan等采用了速率法。[16]這類方法中由Ratnoff 和 Menzzie改良的酚試劑比色法，其曾被提出作為參考方法。近幾年來，不少文獻推薦用Jocobsson的改良法作為纖維蛋白原標準的定值方法。這類方法的缺點是，從理論上講，有兩方面可引起誤差。一是所析出并測定的是纖維蛋白而非纖維蛋白原。已知纖維蛋白原變成纖維蛋白時會從α和β肽鏈上分別切下兩個短肽，即A肽（FpA）和B肽(FpB)。這樣纖維蛋白實際上比纖維蛋白原的質量少了10%。[14]二是已知纖維蛋白旦形成，就會吸附一些凝血因子或纖溶因子，這樣又會增加所測纖維蛋白原的量。此外，本法在操作中在獲取纖維蛋白和洗滌（擠壓）除去其它蛋白成份時，不僅比較麻煩而且也難以完全徹底，會造成其它蛋白污染。

　　第二類方法（物理化學測定法）在我國應用最廣。這類方法又可分為鹽析法（包括用亞硫酸鈉、硫酸銨或氯化鈉鹽析，用蛋白質顯色或比濁法測定），熱變性沉淀法和電泳法等幾種。這類方法都比較簡單、快速，尤其適于急診檢驗，但缺點是本法的特異性不強。所測的不是有凝固功能的纖維蛋白原，可能包括部分的降解產物和/或其它蛋白。而電泳法又太繁瑣，不適于常規工作。
　　第三類方法（免疫學方法），是將純纖維蛋白原作為抗原免疫動物，制成多克隆或單克隆抗體。然后用免疫膠乳、被動血凝或反向血凝、單向免疫擴散、火箭電泳以及ELISA等方法測定。優點是大部分方法簡便，但缺點是所測的不僅是可凝固的纖維蛋白原，可能包括了它的降解產物（因為它們有共同抗原），也可能包括了障礙性纖維蛋白原（dysfibrinogens即N端谷氨酸γ位未羧化的無功能的纖維蛋白原,又稱缺維生素K引起的蛋白質，PIVKA）。但免疫法也有一個好處，就是可用來測定PIVKA。如果一個患者總纖維蛋白原（用免疫學測定結果）不低，甚至增高，而功能性（即可凝固性）纖維蛋白原卻明顯減少，即可判斷為存在PIVKA。肝病、維生素K缺乏等均可導致PIVKA升高，有臨床診斷價值。總的說來，免疫學方法用于臨床常規實驗室仍存在一定問題。

　　近年來，國內引進很多自動血凝分析儀，這些儀器在測PT時往往同時報告纖維蛋白原。其原理和理論根據是：當PT測定完成時，全部纖維蛋白原均變成纖維蛋白（相當于Clauss法血漿中加入了凝血酶），其形成的濁度與纖維蛋白的含量成正比。因此，不需另加任何試劑，即可由濁度直接推算出纖維蛋白原的含量。故本法又稱為PT導出（或衍生）纖維蛋白原測定法，簡稱PT-Der法。關于本法的可靠性，國外不少研究者已作過比較，總的情況是：此法精密度相當高，當血漿纖維蛋白原含量在正常范圍時，PT-Der法與經典的Clauss法無顯著差異或略高于Clauss法；但當纖維蛋白原減低時，PT-Der法往往偏高（p<0.001）,故此法用于纖維蛋白原含量減低者應慎重.國內目前采用此法者已逾來逾多。由于不斷有文獻報道，血漿纖維蛋白原水平的變化不僅與凝血障礙、出血、DIC、應激（因為它也是一種急性期蛋白）有關，而且與冠心病，心肌梗塞有關，因此臨床上倍受重視。不僅工作量增大而且對方法準確性的要求也越來越高。但至今WHO、ICSH和NCCLS仍未明確提出一個纖維蛋白原的標準化或推薦方法，供臨床常規使用。但作為方法標準化的第一步，纖維蛋白的標準已經有國際參考制品；另外用于標準品的標化也有一個推薦方法。以下重點介紹這兩個方面。

　　一、纖維蛋白原的國際標準品
　　1992年英國國家生物標準及控制研究所（NIBSC），研究完成了一個纖維蛋白原標準品，編號為89/644，向WHO和生物標準專家委員會（ECBS）推薦，[15]并被ECBC批準為國際參考品（IRP）。從此，各國均引進這一標準品來標化本國或工廠生產的次級標準品（我國衛生部臨床檢驗中心亦已在引進）。使纖維蛋白原測定的標準化工作，走出了關鍵的一步。因此根據以往的調查。各家標準品纖維蛋白含量互相差別很大，有的竟相差達到200%！

　　二、推薦的測定方法
　　各家用IRP來標化自己的標準時，推薦采用Jacobsson的改良法，現將該法介紹如下。
　　試劑
　　1、緩沖液：Na22H2O 0.882g; KH2PO4 2.77g加水至1L，此為貯存液；將貯存緩沖液1份，加生理鹽水2份即為應用緩沖液，PH為6.35。
　　2、生理鹽水：0.15mo1/L
　　3、人或牛凝血酶，500IU/ml,生理鹽水溶液。
　　4、凝塊溶解劑：尿素400g溶于少量蒸餾水中，繼加入200ml 1.0mol/L NaOH,再加水至1L。

　　操 作：
　　將纖維蛋白原凍干（標準）品（源于89/644）加1ml蒸餾水復溶，加到含有2ml應用緩沖液的有機玻璃淺盤或其它容器中，再加入凝血酶液50ml,迅速混勻，在室溫中靜置2小時。將容器倒扣于吸水的布上（其下可墊吸水紙），再用適當物質（如濾紙）將凝塊吸干。將凝塊取下，置于50ml生理鹽水中洗滌兩次，每次洗滌后均應將凝塊吸干（可用玻璃擠壓凝塊），盡量除去含于凝塊中的液體，以免液體中的其它血漿蛋白殘留。必要時可在清潔棉布上擠壓。

　　小心將凝塊加入含凝塊溶解劑7.5ml的容器中，搖勻，直至凝塊完全溶解后混勻。倒入光徑為1cm的比色杯中，以凝塊溶解劑為空白，在280nm和 315nm波長讀取吸光度（A）。

　　計 算：
　　纖維蛋白原濃度（g/L）=（A280-A315）×7.5/15.87=(A280-A315)×0.47
　　式中15.87為纖維蛋白在堿性條件下波長280nm的消光系數;7.5為 纖維蛋白原的稀釋倍數。
　　當A在1.0以下時，吸光度與濃度呈線性關系。如A大于1.0，應稀釋標本重新測定，重新乘稀釋倍數。
　　上述方法，比較繁瑣，僅適用于參考液的標定。至于常規工作中的纖維蛋白原測定，比較簡便、準確、精密度也較好的是凝血酶凝固時間法，即Clauss法，現介紹如下。

　　三、適于常規工作的纖維蛋白原測定方法（Clauss法）

　　原 理：
　　將凝血酶加到血漿中，使纖維蛋白原變成纖維蛋白，使出現凝固。在有足量的凝血酶時，與不同含量的纖維蛋白原作用，其出現凝固的時間與纖維蛋白原含量呈負相關。
　　試 劑：
　　1、牛凝血酶100NH/ml
　　2、纖維蛋白原標準品（IRP次級標準）
　　3、緩沖液（下列兩種任選一種）：
　　（1）巴比妥緩沖液（PH7.5）；巴比妥鈉2.75g,璐氯化鈉7.3g溶于750ml去離子水中,校正至PH7.5,加水至1L。
　　（2）咪唑（Imidazole, 或 Glyoxaline）緩沖液：咪唑3.4g(0.05M),氯化鈉5.85g，加于約500ml水中；加0.1mol/L鹽酸186ml,調pH至7.3-7.4，最后加蒸餾水至1L。
　　測定步驟
　　1、手工法
　　（1）用上述緩沖液先將標準品稀釋成0.8,1.6,2.4,和4.0g/L纖維蛋白原濃度。各濃度再用緩沖液作1：10稀釋。
　　（2）患者血漿及質控物用緩沖液作1：10稀釋。
　　（3）漿含100NHU/ml,混勻后室溫保存。
　　如用儀器法測定，則用100NIHU/ml,不必稀釋。
　　（4）在一試管中，加稀釋血漿0.2ml,置37℃水浴中4分鐘。
　　（5）加入預溫37℃的凝血酶液0.2ml,搖勻并立即開動秒表,不斷觀察凝固時間。至出現凝固時停表。
　　（6）每份標本測定兩次，求平均數。同時測定各標準管和對照（質控）管，方法相同，準確記錄時間。
　　（7）計算
　　用雙對數計算紙作圖，以凝固時間為縱坐標，纖維蛋白原濃度為橫坐標，將各相應濃度的標準管對凝固時間，在圖上標出相應的點并連成直線，制成標準曲線。然后根據患者和質控血漿所得的凝固時間，在圖上查到纖維蛋白含量。
　　如血漿纖維蛋白含量大于4g/L，應稀釋血漿后重測，結果乘以稀釋倍數。
　　如血漿纖維蛋白含量低于0.8g/L，需漿原血漿改為1：2或1：5稀釋，在標準曲線上查得結果后除以5或除以2。
　　2、儀器法
　　本法可用自動或自動凝血儀，按凝血酶時間（TT）測定法測定。可自動打印出結果。一般儀器法比手工法精密度高，尤其是在含量高時，儀器法比手工法更好。
　　本法的干擾因素主要是肝素。在高濃度時可造成假的低值（可通過加入硫酸魚精蛋白而消除）：PIVKA變可造成假低值。

　　　主要是誤差來源
　　1、血漿稀釋不準確
　　2、凝血酶活性不足或丟失。凝血酶一般應在低溫保存，稀釋后在塑料（聚乙烯）試管中4℃保存,可保存活性24小時.
　　3、測定終點觀察不準確，尤其是纖維蛋白原含量高時，往往在8秒鐘左右即凝固，手工法重復性較差，不易做準。