細胞培養污染拯救及預防方法2

2、支原體污染的檢測

（1）相差顯微鏡觀察

直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現。應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。

（2）熒光染色法觀察

用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。

（3）電鏡檢測

若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。

支原體掃描電鏡圖片

（4）培養檢測

將細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基，培養14天后觀察肉湯培養有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。

3 、病毒的檢測

1) 應用電鏡技術快速診斷動物病毒病

冠狀病毒電鏡圖

2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR檢測病毒

（三）污染的清除

培養細胞一經污染，多數較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養。

若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

一、細菌和真菌的清除

1、使用抗生素

抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。

預防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規培養液。此法在污染早期有效。

二、支原體的清除

１、用MRA處理

用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，每4天換一次液,連續處理15天以確保細胞純潔健康，效果好．

2、用清洗純化法清除支原體污染的方法

細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌

其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至極限。

如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

3、藥物輔助加溫處理

先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。

４、使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經濟。

（四）、污染的預防

預防是防止細胞培養過程中發生污染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發生污染的可能性降到最小程度。

一般預防可從以下幾方面著手：

1、添加抗生素

2、從物品、用品消毒滅菌著手

細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。

操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

3、從操作者做起

（1）進無菌室前要用肥皂洗手，按規定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

（2）操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

（3）操作時要常更換吸管，一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

4、防止細胞交叉污染

在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分。

在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。

細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發生污染可重新復蘇培養。

5、無菌室的徹底消毒

1） 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室；
。
2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。