細胞培養液（二）

第四節 合成細胞培養基

合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養基。它有一定的配方，是一種理想的培養基。目前合成培養基多達10多余種，有的培養基仍在不斷進行改良。早期組織培養是利用天然培養基，目前合成培養基已經成為一種標準化的商品，從zui初的基本培養基發展到無血清培養基、無蛋白培養基，并且還在不斷發展。合成培養基的出現極大的促進了組織培養技術的普及發展。

一、基本組分 基本培養基包括四大類物質：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

無機鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調節細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細胞的培養特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養液中。

維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。

碳水化合物：是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養動物細胞時，幾乎所有培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。

葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的產物。研究表明，體外培養條件下95％的葡萄糖轉變為乳酸，這降低了營養物質的代謝效率，降低培養基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉運系統蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統活性低而不能將糖酵解產生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產生的丙酮酸與NADH反應生產乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導致糖酵解與TCA循環的失衡。因此體外培養條件下，葡萄糖主要經糖酵解降解，產生過量的乳酸。減少乳酸生產zui常用的方法是限制培養基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養供應不足，細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產速率以及目的蛋白的表達量等參數進行綜合考慮方可應用。

在目前常用的培養基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養動物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內完全不同，表現為葡萄糖主要經糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不完全氧化途徑，另一小部分通過完全氧化為細胞供能。因此，適當的調整細胞內的代謝途徑，使之能促進細胞的快速生長和產物合成，同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營養物質葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細胞生長而言，二者的快速利用并非細胞必需；相反相當一部分轉化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細胞生長以及產品質量。減少這兩種代謝產物的積累，是大規模細胞培養技術研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產生的。限制培養基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

除了以上與細胞生長有關的物質以外，培養基中一般還要加入酚紅（當溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當溶液堿性時pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

在較為復雜的培養液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

二、常用細胞培養基

(1)MEM細胞培養基系列（參看本-產品展示）

(2)DMEM細胞培養基系列（參看本-產品展示）

(3)RPMI-1640細胞培養基系列（參看本-產品展示）

(4)199細胞培養基系列（參看本-產品展示）

(5)水解乳蛋白細胞培養基（參看本-產品展示）

(6)歐氏平衡鹽（參看本-產品展示）

(7)F-10,F-12細胞培養基系列（參看本-產品展示）

(8)其它類型細胞培養基 

三、干粉培養基的配制

配制培養基要注意以下問題：

認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據實驗需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質都要等培養基完全溶解之后才能添加。

配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。

所用器皿應嚴格消毒。

配制好的培養基應馬上過濾，無菌保存于4度。

液體培養基主要是為了科研工作的方便而設計的培養基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內毒素等的溶液，可節省科研人員的工作量。

配制方法

在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預期培養基總體積少5％的雙蒸水。

在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養基，輕輕攪拌，不要加熱。

水洗包裝袋的內部，轉移全部的痕量干粉到容器內。

加NaHCO3到培養基中。

用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。

通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調節pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因而調節pH值使它比zui終想要的pH值低0.2到0.3。培養基在過濾前要保持密封。

第五節 無血清技術及其培養基

經歷了天然培養基、合成培養基后，無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可降低生產成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。

無血清培養基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的完全培養基可以滿足大部分細胞培養的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力；或者要大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產物。因此研制出無血清培養基一直是生物科學工作者努力的目標。上海恒利安生物科技有限公司已成功開發了商業化的多種無血清培養基，可滿足眾多廠商的需求。

一、無血清培養基的基本配方:基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。

用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。 

添加組分包括以下幾大類物質：

(1）促貼壁物質：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

(2）促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞*的，如胰島素。

(3）酶抑制劑：培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中*須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。zui常用的是大豆胰酶；抑制劑。

(4）結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。

(5)微量元素：硒是zui常見的。

二、使用方法:目前，血清仍是動物細胞培養中zui基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發生變化。

為了使細胞適應無血清培養，關鍵的是使所培養細胞：

處于對數生長中期

>90% 活細胞率

適應時以較高的起始細胞接種

有兩種方法使細胞適應無血清培養基（SFM）:

1、直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中。

一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4到7天后達到2×106~4×106細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培養基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

2、連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。

以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75%有血清培養基：25％SFM 混合培養基中，傳代培養。

當細胞密度>5×105細胞/ml時，以2×105到3×105細胞/ml細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。

以2×106到3×106細胞/ml細胞密度，25％有血清培養基和75% SFM中傳代培養。

當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養基中傳代培養。

每隔3到5天，當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。

在適應過程中，不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。

細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2到3次。

培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發生，4允許進行2到3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。

特別需要強調的是：配制無血清培養液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。 

三、使用無血清培養基的優點

增加確定性

性能更加一致

容易進行純化和下游加工

細胞功能的評估

增強生長和/或產量

生理反應性的較好對照

增強細胞內中介物的檢測

第六節 無蛋白培養基與限定化學成分培養基

一、無蛋白培養基（protein free midium,PFM）:即不含有動物蛋白的培養基。無血清培養基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術發展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養基又廣泛的應用前景，許多利用基因工程技術重組的蛋白質zui終要應用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質的培養基，純化過程就比較復雜，zui終要達到一定的質量標準也有一定的難度。無蛋白培養基就是為了適應這發展趨勢而出現的，許多無蛋白培養基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細胞生長的無蛋白培養基。

二、限定化學成分培養基(chemical defined medium,CDM):是指培養基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養基更有利于分析細胞的分泌產物。目前已經有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM問世，上海恒利安生物科技有限公司生產的水解乳蛋白培養基就屬于CDM。

第七節 其他細胞培養用液

在細胞培養過程中，除了培養基外，還經常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調整液等。

一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）:主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。zui簡單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個主要區別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的環境，若放入CO2培養相，溶液將迅速變酸，使用時應注意。

配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液:取材進行原代培養時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因為這些物質會對胰酶產生抑制作用。胰酶作用及溶解的zui佳pH是8-9，配制胰酶溶液應將液體調至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調只pH7.5，也可不調。

使用細胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細胞清洗液（100ml細胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝于4度保存。

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的zui佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時可用PBS。 

三、pH調整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

1、NaHCO3溶液：NaHCO3是培養基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養基在5%CO2的環境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養，即不與5%CO2的環境發生交換達到平衡，所使用的培養基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調節培養基，使之達到所要求的pH環境。

2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養基pH迅速變動。在開放式培養條件下，觀察細胞時培養基脫離了5%CO2的環境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養基配制。

五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養液內。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時應加溫30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。使用時，在每100ml培養液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細胞培養液中L-谷氨酰胺是大部分細胞培養基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發降解；需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。因而在培養操作過程中經常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在細胞培養中穩定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨zui少!

二肽谷氨酰胺在細胞內被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細胞系統中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是*替代物，它無需適應；既可用于貼壁細胞培養，也適合于懸浮細胞的培養。