大鼠腦微血管內皮細胞原代培養可以：（1）應用于血腦屏障的研究；（2）腦血管疾病的病理生理及分子生物學研究；（3）新藥篩選；（4）腦微血管內皮細胞生理生化及藥理學研究。
酶消化法
SD大鼠
纖連蛋白 Ⅳ型膠原 明膠 肝素鈉 堿性成纖維細胞生長因子 青霉素 鏈霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾膠 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型膠原酶
低溫離心機 離心管 移液槍
一、實驗材料準備
1. 實驗動物
每次實驗采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。2. 試劑
纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原、鼠尾膠、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購自Sigma公司；D-Hanks'液、10×PBS按配方自制；II型膠原酶購自Worthington公司；明膠、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購自Amresco公司；Percoll 購自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)購自GIBCO/BRL公司；肝素鈉、NaHCO3購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；青、鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)購自PAA Laboratories；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購自Roche公司。
3. 儀器
低溫離心機(Centrifuge 5810 R，購自Eppendorf；Himac CR 22F，購自Hitachi)。
4. 試劑配制
（1）1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制)，1%明膠(用D-Hanks'液配制)，1%II型膠原酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%的濃度)，1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，調pH值至7.4后用0.45 μm濾膜過濾除菌，較難過濾)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/μl)，以上試劑經0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20℃。（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10×PBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培養液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素鈉 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml)，pH值調至7.4，過濾除菌后分裝保存于4 ℃，用時加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
二、培養皿預處理
1. 涂布3種不同的基質，培養前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養皿，置于37 ℃培養箱過夜，接種前用D-Hanks'液漂洗2次。2. 接種前4 h，加入鼠尾膠6~10 μg/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后，置于室溫1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。3. 50 μl 0.1%纖連蛋白、50 μl 1 mg/ml Ⅳ 型膠原和400 μl雙蒸水混合后，加入到每個培養皿中涂布均勻后吸出，可涂布10個培養皿，置于37 ℃培養箱1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。
