[9].制作平板培養基：將剛剛滅過菌的盛有培養基的錐形瓶和培養皿放在實驗臺上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養皿蓋，右手迅速將培養基倒入培養皿中，每皿約倒入10ml，以鋪滿皿底為度。鋪放培養基后放置15min左右，待培養基凝固后，再5個培養皿一疊，倒置過來，平放在恒溫箱里，24h后檢查，如培養基沒有長雜菌，即可用來培養微生物。
[10].無菌檢查：將滅菌的培養基放入37℃的細菌培養箱中培養24~48h，以檢查滅菌是否徹底。
2、細菌的復蘇
[1].復蘇菌種前應準備適于該菌種生長的固體、液體培養基和培養設備，所有操作均應在符合生物安全保護及無菌條件下進行。
[2].啟開菌種宜采用鋸開法（鋸開前用70%酒精棉消毒菌種管外壁）。用吸管將液體培養基0.3ml左右注入被啟開的菌種安瓶中并吹打，使安瓶中的凍干菌種溶解成菌懸液。
[3].將上述菌懸液全部吸出，分別接種到固體斜面和液體培養管中，一般放置在37℃培養箱培養18~24h（具體接種方法見下面的實驗介紹）。
[4].次日觀察菌種的生長情況，如菌種未生長，應繼續培養至72h。
[5].復蘇后的菌種在傳1~2代后使用。
[6].暫不啟開的安瓶及復蘇后需保藏的斜面應于4℃中保藏。
3、細菌的培養
[1].固體平板培養基培養
A.右手持接種環，經火焰滅菌，待涼后，挑取大腸桿菌保存液少許。
B.左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的1/10），劃線時接種環與平板表面成30~40o角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動作，接種環不應劃破培養基表面。
C.燒灼接種環，殺滅環上殘留細菌，待冷（是否冷卻，可先在培養基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續平行劃線，約占平板表面1/5左右，再次燒灼接種環，等三次平行劃線；以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標簽或臘筆注明菌名檢驗號碼，接種者班級，姓名，組別等，置37℃孵育培養24h后觀察結果。
[2].液體培養基培養
無菌操作基本方法同前面的步驟。吸取10μl保存液，沿液體培養基的三角瓶瓶壁接近液體表面之管內壁輕輕將菌液加入液體培養基中（勿用力振蕩），使細菌混入培養基內，塞好棉塞，用牛皮紙包扎好，置于37℃水浴搖床中200rpm培養，次日觀察結果。
[3].斜面培養基接種法
A.左手持菌種管與培養基管，斜面皆向上，菌種管在外側，右手如拿毛筆的姿勢持接種環，將鉑絲與欲進入試管的柄部通過火焰滅菌。
B.右手的小指與掌心夾下培養基管棉塞，第四指與小指夾下菌種管棉塞，管口通過火焰。
C.接種環伸入菌種管，沾取少許菌種。
D.接種環伸入培養基管，在斜面上蜿蜒劃線。注意沾有菌種的接種環不可碰管口與其它地方。
E.管口再通過火焰，并將棉塞塞于原來的試管。
F.接種環再滅菌。
4、細菌的保種
[1].短期固體培養基保藏（斜面試管培養基保存法）：
按照上面的方法劃線接種于斜面試管培養基中，37℃過夜培養。將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。定期進行傳代培養、再存放。
[2].長期甘油冷凍保藏：
A.在液體培養基中生長的細菌培養物：取0.85ml細菌培養物，加入0.15ml高壓滅菌甘油，振蕩培養物使甘油分布均勻，然后轉移到標記好的保存管內，密封，
在乙醇－干冰或液氮中凍結后再轉至-70℃長期保存。在復蘇時，用滅菌接種針刮取凍結的培養物表面，然后立即把黏附于接種針上的細菌劃于含適當抗生素的LB瓊脂平板表面，于37℃過夜。
B.在瓊脂平板上生長的細菌培養物：從瓊脂平板表面刮下細菌放入裝有2ml
LB的無菌試管內，再加入等量的含有30％滅菌甘油的LB培養基，振蕩使甘油完全分布均勻后，分裝于無菌保存管內，密封，再按前述方法冰凍保存。這一方法的優點在于可用于保存在質粒載體上建立的cDNA文庫。
5、感受態細菌的制備（CaCl2轉化法）
[1].劃線復壯宿主菌37℃過夜。挑一單菌落于30ml LB液體培養基中，37℃，200rpm搖至OD600=0.2~0.4，取出置于冰上10~15min。
[2].取1mL菌液于滅菌的1.5ml離心管中。4℃，5000rpm離心5min回收細胞。棄上清，吸干殘存培養基，加500μl冰預冷的0.1M CaCl2，重懸菌體，置冰浴15~30min。
[3].4 ℃5000rpm離心5min回收細胞。棄上清，吸干水，加100μl冰預冷的0.1M CaCl2重懸菌體。放置于4℃用于轉化，若不用則加30%甘油置-70℃備存。
注意事項：
[1].滅菌后的所有操作都應該在無菌的情況下進行。
[2].配制藥品、培養基等均用超純水。