實驗方法原理
實驗材料 精核
試劑、試劑盒 HAP 緩沖液BioGel HTP 粉(Bio-Rad)Bio-Rad 蛋白定量系統(可選)
儀器、耗材 2 cm×15 cm 柱及附件 Centriprep-10 濃縮器(Amicon; 可選)
實驗步驟
1. 用 25 ml HAP 重懸約 2 ml 精核(約含有 6 mg DNA),4℃ 輕輕攪動 10 min。
2. 邊攪動,邊加入 10 g BioGel HTP 干粉。
3. 加入足夠的 HAP 緩沖液使成漿狀,并加入到 2 cm×15 cm 柱中,收集洗脫液。
4. 用 10 體積的 HAP 緩沖液洗滌樹脂(約 300 ml 以 30 ml/h 的速度)。
5. 用含有 2.5 mol/L NaCl 的 HAP 緩沖液洗脫核心組蛋白,每 8 ml 收集一管。
6. 測量 A230 或 A280 值或者使用蛋白質定量系統,確定蛋白質的濃度,將同一蛋白質峰的成分合并。
組蛋白 A230 的消光系數(雖然計算源自雞的紅細胞組蛋白,但是與哺乳動物組蛋白的相近)為 4.3 U/mg 組蛋白/ml。另外,Bio-Rad 或其他蛋白質定量系統可以通過以 BSA 為標準測得。使用 BiaRad 蛋白質定量系統測得的濃度比使用 A230 的方法高 1.6 倍。
7. 通過測定傳導讀數確定已合并的每個庫成分的鹽濃度。鹽濃度應為 2 mol/L 左右。
8. 如通過 SDS-PAGE 確定核心組蛋白的純度。
9. 如有需要,使用 Centriprep-10 濃縮器濃縮核心組蛋白至濃度為 2~10 mg/ml。
10. 分裝液體,在干冰上速凍,可在 -80℃ 保存 4 年左右。