（二）聚丙烯酰胺凝膠的性能及制備原理
1．性能
聚丙烯酰胺凝膠的機械強度好，有彈性，透明，相對地化學穩定，對pH和溫度變化較穩定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的，沒有吸附和電滲作用。原料成分要采用高純度制品，通過改變濃度和交聯度，可以控制孔徑變動在極廣泛的范圍，并且制備凝膠的重復性好，由于純度高及不溶性，因此還適于少量樣品的制備，不致污染樣品。
2．制備原理
聚丙烯酰胺是用丙烯酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（N,N,N＇,N＇-methylene bisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑的作用下聚合而成。它們的結構式見下頁。
聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：
（1）化學聚合：化學聚合的催化劑通常多采用過硫酸銨（ammonium
persulfate，簡稱AP）或過硫酸鉀，此外還需要一種脂肪族叔胺作為加速劑，最有效的加速劑為N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺（N,N,N＇,N＇-tetramethyl
ethylenediamine，簡稱TEMED），其次為三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile，簡稱
DMPN）。在叔胺的催化下，由過硫酸銨形成氧的自由基，后者又使單體形成自由基，從而引發聚合作用。叔胺要處于自由堿基狀態下才有效。所以在低pH時，常會延遲聚合作用。分子氧阻止鏈的延長，妨礙聚合作用，一些金屬離子也能抑制聚合。冷卻可以使聚合速度變慢。通常控制這些因素使聚合在1小時內完成，以便使凝膠的性質穩定。
（2）光聚合：光聚合通常用核黃素為催化劑。不一定加TEMED即能聚合，但加入則可加速聚合。
光聚合通常需要有痕量氧存在，核黃素經光解形成無色基。后者被氧再氧化形成自由基，從而引發聚合作用。但過量的氧會阻止鏈長的增加，應該避免過量的氧存在。
光聚合通常用日光燈或普通鎢絲燈泡作光源，直接日光或室內強散射光也可以。
用核黃素進行光聚合的優點是：①核黃素的用量很低（1毫克/100毫升）；②通過光照可以預定聚合時間，但光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時間延長而逐漸變小，不太穩定，所以用它制備大孔凝膠較適合。化學聚合的凝膠孔徑較大，因而采用過硫酸銨-TEMED催化系統制備小孔凝膠（分離膠），而且制備的重復性好。
3．凝膠濃度和交聯度與孔徑大小的關系
凝膠濃度與被分離物的分子量大小的關系，大致范圍如表15-1。
聚丙烯酸胺：
常用的所謂標準凝膠是指濃度為7.5%的凝膠，大多數生物體內的蛋白質在此凝膠中電泳能得到滿意的結果。當分析一個未知樣品時，常常先用7.5%的標準凝膠或用4—10%的凝膠梯度來試測，而后選出適宜的凝膠濃度。
凝膠的機械性能、彈性是否適中是很重要的，膠太軟易于斷裂，尤其在制作板型電泳的薄片狀凝膠時，太軟很難操作。太硬則脆，也易折斷。凝膠的透明度、粘著度是否合適也影響分離效果。凝膠的機械性能、彈性、透明度和粘著度取決于凝膠總濃度和 Acr與Bis兩者之比例。
凝膠密度或凝膠濃度，可以用二個字母T和C來定義。T代表丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺二個單體的總百分濃度。C代表總濃度T中交聯劑Bis的百分濃度。Hjertern，S.推導出如下這個式子，用以計算凝膠的用量。
這里 為丙烯酰胺的量（g）
b為亞甲基雙丙烯酰胺的量(g)
m為緩沖液體積（ml）
/b的值是有臨界線的，如果 /b＜10，制成的凝膠脆而易碎，堅硬而不透明。如果 /b＞100，即使5%的丙烯酰胺也是糊狀的，容易破碎。 /b的值接近30 時，（其中丙烯酰胺的量必須＞3%），可以制成既有彈性又完全透明的凝膠。
Davis,B.J.在1964年，研究了丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的濃度范圍，分別為1.5—60%和0—0.626%之間的凝膠形成情況。他發現丙烯酰胺濃度＜2%，亞甲基雙丙烯酰胺濃度＜0.5%，不發生聚合凝固作用。為了獲得一種有彈性的凝膠，在增加丙烯酰胺濃度的同時，應適當減低亞甲基雙丙烯酰胺的濃度。對于這個要求，Richards,E.C.等人提出了如下一個經驗公式：
C=6.5―0.3T
濃度在5—20%范圍內，可以應用這個式子容易地計算凝膠的組成用量。式中C可有1%的變化。
對于人血清蛋白質的分離，Brackenridge,C.J.等人，推導出了下面這個經驗式，用以計算最適的凝膠濃度，以便獲得最好的分辨率。
B=0.201―0.0112T
這里，B 代表亞甲基雙丙烯酰胺的百分濃度，T為二個單體總的百分濃度。
用于研究大分子核酸的凝膠多為大孔徑凝膠，太軟，不易操作，最好加入0.5%瓊脂糖。有的在3%凝膠中加20%蔗糖，也可增加機械強度而又不影響孔徑大小。
（三）幾種染料的性能及染色原理
1．氨基黑 10B（amino black 10B）
C22H13O12N6S3Na3
MW=715，λmax=620―630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基與蛋白質反應構成復合鹽。是最常用的蛋白質染料。但用氨基黑染SDS-蛋白質時效果不好。另外，氨基黑染不同蛋白質時的著色度不等，色調不一（有藍、黑、棕等），作同一凝膠柱的掃描時誤差較大，需要對各種蛋白質作出本身的蛋白質-染料量（吸收值）的標準曲線。
2．考馬斯亮藍R250（Coomassie brilliant blue R250）。C45H44O7H3S2Na，MW=824，
λmax=560―590nm。染色靈敏度比氨基黑高5倍。尤其適用于SDS電泳微量蛋白質染色。但蛋白質濃度超出一定范圍時，對高濃度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析時要注意這點。
3．考馬斯亮藍G250，又名Xylene brilliant
cyaninG。比考馬斯亮藍R250多二個甲基。MW=854；λmax=590―610nm。染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。優點在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用于需要重復性好和穩定的染色，適于作定量分析
4．1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic
acid，簡稱ANS），本身無熒光，但與蛋白質結合后則產生熒光。電泳后，取出凝膠入在平皿中，用此染料溶液浸1—3分鐘，用長波紫外燈照射時，產生黃色熒光。可顯示蛋白質100微克，如果不明顯，可將凝膠取出暴露于空氣或鹽酸氣中，或浸沒在3mol·L-1鹽酸中幾秒至2分鐘，使表面蛋白質稍變性，然后再用ANS染色，這樣可顯示蛋白質20微克。
這樣的染色優點是可保留凝膠內部的酶和抗體的活性。可將該區帶切下來進行酶活力測定；也可直接把凝膠搗碎研細，用作抗原來注射動物，聚丙烯酰胺不影響抗體的產生。
聚丙烯酰胺盤狀電泳具有使樣品區帶濃縮變窄的作用，所以分辨力高，在很多情況下超過超速離心和常用的層析及一般電泳技術；設備簡單，樣品量小（1—100微克）；時間短，操作方便，可分離物質的分子大小范圍廣泛，由多肽到核糖核蛋白體及病毒都可以分離，亦可改變為超微量測定（10-9—10-12克），并可結合SDS來測定蛋白質亞基分子量；或測定核酸等的分子量。這種方法現在幾乎代替了超速離心沉降法。它還可以結合等電點聚焦電泳以提高分辨率。
聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳用途較廣，對生物高分子化合物能進行分離、定性、定量分析，又能用于制備毫克水平的材料。
三、器材及試劑：
1．器材：
①血清以及其他蛋白質樣品。
②圓盤電泳槽、穩壓直流電源（500V）。
③玻璃管0.5×7―10cm（×1）及制膠架。
④日光燈。
⑤三角燒瓶。
⑥注射器10ml（×1）、長針頭。
⑦滴管。
⑧培養皿￠10cm（×5）。
⑨吸管1ml（×1）、2ml（×1）、5ml（×1）、0.5ml（×1）。
⑩凝膠成像系統或光密度計。
2．試劑：
①丙烯酰胺（Acr）：分析純。如不純，可按下法重結晶：90g丙烯酰胺，溶于500ml50℃氯仿，熱濾，濾液用鹽冰浴降溫，即有結晶析出。砂芯漏斗過濾，收集結晶。按同法再重結晶一次。結晶于室溫中趕盡氯仿（約得50g左右，M.P84.3℃），貯棕色瓶中，干燥低溫保存（4℃）。
②N，N＇- 亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）：分析純。如不純按下法處理：12g亞甲基雙丙烯酰胺，溶于1000ml40—50℃丙酮。熱濾，濾液慢慢冷至-20℃，結晶析出，砂芯漏斗吸濾，結晶用冷丙酮洗數次，真空干燥。貯棕色瓶，干燥低溫（4℃）保存。
（注意：Acr和Bis都是神經毒劑，對皮膚有刺激作用，應在通風櫥內操作。操作者需戴醫用乳膠手套）
③N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（簡稱TEMED）：密封保存。可用N-二甲基氨基丙腈或三乙醇胺代替，但效果較差。
④三羥甲基氨基甲烷（簡稱Tris）。
⑤核黃素：避光保存。光聚合催化劑。
⑥7%醋酸溶液（V/V）。
⑦0.5%氨基黑10B（C22H13O12N6S3Na3）溶液：用7%醋酸溶液配制。
⑧0.01%溴酚藍溶液。
⑨蔗糖。
⑩PH8.4硼酸緩沖液（0.2mol·L-1硼酸鹽）。
四、操作步驟：
1．貯備液的配制：按表15-2配制A、B、C、D、E、F各貯備液：
表15-2 貯備液配制