腫瘤靶向藥物成像的未來發展PI與MALDI成像相結合

　　摘要

　　在過去的十年中，人們從研究植物代謝組學到發現疾病的生物標志物研究，再到開發新的療法，基質輔助激光解吸電離（MALDI）成像技術已成為這些研究中不可或缺的工具。MALDI 技術通過提供對治療化合物及其代謝物的直接分布監控以及非靶向藥效學信息，革新了臨床前藥物開發流程。

　　目前，MALDI 成像的一個重要應用是腫瘤學的組織分析，同時MALDI技術的最新發展有望為癌癥研究帶來更大的好處。MALDI 與激光誘導電離（PI）的組合可增強藥物化合物和其他化合物的檢測和成像，使得 MALDI 成像在研究腫瘤組織中藥物代謝和藥效學方面取得了重大進展。

　　本文介紹了 MALDI 成像技術在腫瘤學應用中的價值，并探討了 PI 技術的發展潛力，包括實現高至三個數量級的更高靈敏度，且使用傳統 MALDI 無法檢測到代謝產物成像分析。

　　MALDI 技術起源于1980年代后期，其最早設計目的是作為質譜（MS）電離方法(1)。后來在1994年被發展成為一種成像技術，可繪制包括從小分子代謝物到沒有標簽或標記的大分子蛋白(2)的稀薄切片樣品中分子的分布圖。隨后，Richard Caprioli 和他的同事(3)將這種方法擴展到組織切片分析中。他們開創性的研究表明，MALDI-MS 可將細胞和組織中的大型生物分子（例如蛋白質和脂質）可視化，進而揭示這些分子以及癌癥等疾病如何改變分布。

　　在過去的二十年中，隨著技術和方法學的進步，不斷提高的分析通量和空間分辨率大幅提高了 MALDI 的成像性能。這些發展推動了 MALDI 在腫瘤學、神經病學、心臟病學和風濕病學等生物醫學研究領域應用中的接受程度。在基于組織的成像研究中，人們首次使用 MALDI-MS 分析組織中的蛋白空間分布，并且提供有關單個蛋白質、蛋白質變體和翻譯后修飾（PTM）的分布信息(4)。與傳統的免疫組織化學（IHC）實驗不同，通過使用MALDI成像技術，研究人員可以同時定位數百種蛋白質。

　　從那時起，MALDI 成像技術已擴展到傳統蛋白質組學之外，成功的用于測量小分子、代謝產物、脂質、聚糖、核酸等。MALDI-MS 優于 IHC 等傳統技術的另一個主要優勢，是能夠對化合物進行成像。通過使用這種非靶向研究，研究人員可以測量以前沒有表征過的疾病途徑分子特征。

MALDI 腫瘤影像學

　　將 MALDI 成像用于癌癥研究應用的論文已經大量發表。長期以來，該技術一直用于發現和監測潛在治療化合物及其代謝產物，同時將其用于分析組織蛋白的潛在臨床價值，以便實現癌癥的早期診斷、預后和預測。傳統藥物研發中的安全、有效藥物發現和開發都是基于血漿中母體藥物的檢測。但是，血漿中發現的大多數藥物靶標都是在發生作用的尾端并被稀釋，因此確定并提供母體藥物及其代謝產物的相關組織分布，有助于人們更好地了解藥理學和毒理學概況。

　　常規分析方法，例如全身放射自顯影（WBA）和液相色譜-質譜（LC-MS），他們雖然提供了一些與組織相關的信息，但又分別受到放射性標記探針和勻漿組織提取物要求的限制，無法提供更全面的信息。MALDI 成像相對于兩種方法均具有優勢：作為一種無標記技術，MALDI 成像可以將母體藥物、代謝物、雜質和降解產物檢測為單獨的實體，從而生成有關藥物化合物和重要代謝物定位的重要信息；與 LC-MS 不同，MALDI 成像可以提供高度局部化的分析物空間信息，在傳統的提取和勻漿過程中可能會忽略這些信息。

發現生物標志物

　　MALDI 成像為新的疾病生物標記發展做出了重要貢獻，特別是在癌癥研究領域。由于癌細胞和組織的異質性，保持空間完整性變得至關重要，而這種分析非常適合 MALDI 成像。特別是 MALDI 成像已成功檢測出癌癥中未知的蛋白質，尤其是聚糖生物標志物的發現大幅推進了癌癥研究進展。在此類研究中，MALDI 成像已用于表征癌癥組織中的 N-連接聚糖分析，同時幫助研究人員開發出腫瘤特異性聚糖生物標記物。

　　據估計，超過 50％ 的人類蛋白質是糖基化的，而糖基化是人類最常見和最復雜的后修飾之一(5)。在病理學水平上，雖然糖基化的變化對腫瘤研究具有重要意義，但人們仍未有效證明它。直到最近，人們將 MALDI 成像技術用于 N-連接的聚糖分析，成功的將糖基化過程在組織中直接定位，同時為不同的聚糖匹配不同的組織特征。例如，在一項對透明細胞腎細胞癌（ccRCC）的研究中（一種通常在晚期階段對化療和放療產生高抵抗力的腎臟癌普遍亞型），MALDI 成像能夠識別多種 N-聚糖ccRCC(6)。圖1 顯示了代表性的 ccRCC 組織中的 N-聚糖譜圖，它具有被原纖維囊隔開的腫瘤（Fuhrmann 2級）和非腫瘤切片。用 MALDI 成像評估 N-糖基化和其他聚糖類能幫助臨床醫生提供新的治療和診斷測定線索。

圖1：生物標記物發現：代表性 ccRCC 組織的 N-聚糖的質譜成像圖。通過 MALDI-FT-ICR 成像分析了Furhmann 2級 ccRCC 組織的N-聚糖分布。（a）H＆E染色顯示特定區域的三個聚糖的重疊圖像：原纖維（藍色；m / z = 2122.7245，Hex5HexNAc4Fuc1NeuAc1），非腫瘤（綠色；m / z = 2523.9088，Hex6HexNAc6Fuc2）和腫瘤（紅色；m / z = 2539.9037，Hex7HexNAc6Fuc1）。（b）具有二等分的 GlcNAc 的 N-聚糖和位于非腫瘤區域的多個巖藻糖基化殘基。（c）高甘露糖 N-聚糖的分布。根據 CCBY-NC-ND 4.0，從參考文獻（6）中復制。

診斷潛力

　　癌細胞和其他患病組織具有影響基因組表達級聯的重要遺傳和表觀遺傳修飾。無論是研究蛋白質組、脂質組還是代謝組，化合物的空間分布都包含重要信息。因為組織水平通信網絡是癌癥生長必不可少的因素，而空間信息有助于增加上下文線索，因此缺少空間信息的組學生物標志物探索可能會受到限制。MALDI 成像能夠識別可用作預測或預后生物標志物，并充當將患者分為合適的治療組并預測對治療反應的角色(7)。

　　腫瘤亞群表征

　　監測腫瘤的發展對控制和成功治療癌癥起到至關重要的作用。然而，腫瘤的異質性對有效藥物的開發以及準確的預后和診斷提出了重大挑戰。通過確定不同腫瘤亞群并詳細了解局部分子變化對成功治療起到決定性作用，MALDI 成像逐漸成為表征腫瘤異質性的工具。

　　一項研究將脂質的 MALDI 成像與深度蛋白質組覆蓋相結合，利用 LC-MS/MS 發現乳腺癌腫瘤亞群的生物標志物和分子特征(8,9)。通過基于激光顯微切割（LMD）的微蛋白質組學（timsTOF fleX，Bruker Daltonics）分析腫瘤內異質性，可使用腫瘤切片中的脂質成像來劃定感興趣目標區域（ROI）。在這項研究中，研究人員使用同一組織切片進行成像、染色和基于 LMD 的顯微技術分析是有好處的。圖像處理后，將腫瘤亞群區域的邊界轉移到同一連續切片的光學圖像中，參考該切片一起掃描的示教標記（圖2）。這項研究讓 MALDI 成像技術與 LMD 進行配準，進而精確切割感興趣的區域。

圖2：圖像處理流程，用于從原始數據中分割生成感興趣區域（ROI）邊界信息，x和y軸作為激光捕獲顯微切割（LMD）坐標。該工作流程包括平滑、去除小物體、填充孔、邊界檢測和放大光學圖像。

　　通過對蛋白質的提取和胰酶切的顯微微切割后，使用 PASEF 進行蛋白質組學分析。蛋白質組學數據分析為原位細胞類型特異性生物過程提供了全面的機制理解，同時補充了工作流程。

成像技術的發展

　　MALDI-MS 與離子淌度（IMS）技術的結合，極大地拓寬了 MALDI 分析化合物的范圍。IMS 的出現為質譜分析增加了另一個維度。在過去的二十年中，IMS 技術的出現使得人們能夠快速分離和分析復雜混合物（例如組織和細胞）中的生物分子。其原因是等質量脂質分子在分析之前，質量相近脂質、肽段和寡核苷酸分子已在流動性細胞中預先分離。IMS 技術有很多種類，但近年來在組織成像方面做出了重大貢獻的IMS 技術是捕獲離子淌度譜（TIMS）。利用 TIMS 通過遷移率來分離離子，進而提高了靈敏度，同時 CCS 供了其他的可能性。

　　MALDI-TIMS 成像平臺的引入極大地增強了從單個組織切片獲得的信息量，提高了全面研究生物過程（如癌癥）分子驅動因素的能力。然而，自從發明 MALDI 以來，靈敏度真正的飛躍是增加了激光誘導后電離（PI）技術(10)。這是由明斯特大學研究人員開發的技術。研究表明，這種新方法將許多化合物的成像靈敏度提高一至三個數量級，尤其是在藥物代謝和藥代動力學（DMPK）研究中，極大地擴充了 MALDI 的應用范圍。

　　通過增強分子信號，激光誘導 PI 不同于傳統 MALDI 技術，尤其是對脂質，小分子和許多藥物化合物來說，無需離子化。例如，一項研究表明，與傳統的 MALDI 分析相比，通過激光誘導的 PI 分析的 70% 以上的藥物化合物，其信號強度提高多達兩個數量級(11)。靈敏度的提高使藥物化合物分布可視化，進一步證明了激光誘導PI成像在藥物研發中的潛力。

　　類固醇

　　類固醇是在植物、動物和真菌中普遍存在的一類重要的生物化合物。人們對研究類固醇在組織中的分布產生了極大的興趣。但是直到現在，由于其非極性核心結構，人們在使用 MALDI 分析類固醇化合物時仍不能很好地將其離子化。許多類固醇常用于癌癥治療，或者作為化學療法的一部分直接縮小腫瘤，或者作為抗炎藥或治療惡心、反胃。圖3 顯示與傳統 MALDI 成像相比，用于癌癥治療的三種關鍵類固醇的激光誘導PI的靈敏度顯著提高(12)。潑尼松龍的靈敏度增加了 100 倍，阿霉素增加了 25 倍，紫杉醇增加了至少 500 倍。

圖3：類固醇成像技術的發展有助于提高類固醇的敏感性（a）潑尼松龍，（b）阿霉素和（c）紫杉醇。對于潑尼松龍，將稀釋液獨立地點到肝勻漿上，然后用激光誘導的電離后（PI）開啟和關閉進行成像。對于阿霉素和紫杉醇，將單一稀釋液點樣在肝勻漿上，然后通過激光誘導的電離后（PI）開啟和關閉進行成像。

　　通過對這些化合物進行成像，研究人員可以更好地了解類固醇在組織中的分布情況，進而改善它們在癌癥治療中的使用方式。

持續創新

　　激光誘導 PI 引入影像學領域將徹底改變臨床研究，同時使臨床診斷受益，尤其是腫瘤學領域。激光誘導 PI 已應用于 MALDI-ESI 雙離子源質譜儀。結合高質量精度和先進的 MALDI 成像技術，分離和識別復雜混合物中的待測物，如脂類和聚糖(13)。隨著這項新技術在未來幾年內與最先進的質譜儀相結合的不斷發展，這將改變新的癌癥生物標志物發現，同時優化治療方案、預后和診斷。

　　參考文獻

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　　(9) F. Dewez, J.Oetjen, C. Henkel, R. Hebeler, H. Neuweger, E. De Pauw, R.M.A. Heeren, B.Balluff, Proteomics (2020) https://doi.org/10.1002/ pmic.201900369.

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　　(12) “Caution!MALDI-2 detects analyte classes never seen before,” Application Note, Bruker Daltonics (2020).

　　(13) J. Soltwisch, B. Heijs, A. Koch, S. Vens-Cappell, J.H?hndorf, and K. Dreisewerd, Anal. Chem. 92(13), 8697–8703 (2020).