實驗概要
本實驗利用酮體測定法對脂肪酸的β-氧化進行了測定，介紹了該方法的原理及步驟等。
實驗原理
酮體包括乙酰乙酸、b—羥丁酸和丙酮三種物質。在肝臟中，脂肪酸經b—氧化作用生成乙酰CoA。生成的乙酰CoA可經代謝縮合成乙酰乙酸，而乙酰乙酸既可脫羧生成丙酮，又可經b—羥丁酸脫氫酶作用被還原生成b—羥丁酸，三種物質統稱酮體。酮體為機體代謝的正常中間產物，在肝臟中生成后須被運往肝外組織才能被機體所利用。在正常情況下，動物體內含量甚微；患糖尿或食用高脂肪膳食時，血中酮體含量增高，尿中也能出現酮體。
本實驗用丁酸做底物，將之與新鮮的肝勻漿一起保溫后，再測定其中酮體的生成量。
因為在堿性溶液中碘可以將丙酮氧化為碘仿（CHI3），所以通過用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）滴定反應中剩余的碘就可以計算出所消耗的碘量，進而可以求出以丙酮為代表的酮體含量。有關的反應式如下：
根據滴定樣品與滴定對照所消耗的硫酸鈉溶液體積之差，可以計算由丁酸氧化生成丙酮的量。
主要試劑
1. 10%（w/v）氫氧化鈉溶液：稱取10g氫氧化鈉，在燒杯中用少量蒸餾水將之溶解后，定容至100ml。
2. 0.1mol/L正丁酸溶液：稱取13g碘和約40g碘化鉀，放置于研缽中。加入少量蒸餾水后，將之研磨至溶解。用蒸餾水定容到1000ml，在棕色瓶中保存。此時可用標準硫代硫酸鈉溶液標定其濃度。
3. 0.5mol/L正丁酸：取0.05ml正丁酸，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液100ml溶解即成。
4. 0.1mol/L碘酸鉀（KIO3）溶液：稱取0.8918g干燥的碘酸鉀，用少量蒸餾水將之溶解，最后定容至250ml
5. 0.1mol/L硫代硫酸鈉（Na2S2O3）溶液：稱取25g硫代硫酸鈉，將它溶解于適量煮沸的蒸餾水中，并繼續煮沸5min。冷卻后，用冷卻的已煮沸過的蒸餾水定容到1000ml。此時即可用0.1mol/L碘酸鉀溶液標定其濃度。
6. 硫代硫酸鈉溶液的標定：將蒸餾水25ml、碘化鉀2g、碳酸氫鈉0.5g、10%鹽酸溶液20ml加入一支錐形瓶內。另取0.1mol/L碘酸鉀溶液25ml加入其中，然后用硫代硫酸鈉溶液將之滴定至淺黃色。再加入0.1%淀粉溶液2ml，然后繼續用硫代硫酸鈉溶液將之滴定至藍色消褪為止。
另設一空白，其中僅以蒸餾水代替碘酸鉀，其余操作相同。計算硫代硫酸鈉溶液的濃度所依據的反應式如下：
5KI KIO3 6HCI=3I2 6KCI 3H2O
I2 2Na2S2O3=Na2S4O6 2NaI
7. 10%(v/v)鹽酸溶液：取10ml鹽酸，用蒸餾水稀釋到100ml。
8. 0.1%(w/v)淀粉溶液：稱取0.1g可溶性淀粉，置于研缽中。加入少量預冷的蒸餾水，將淀粉調成糊狀。再慢慢倒入煮沸的蒸餾水90ml，攪勻后，再用蒸餾水定容至100ml。
9. 0.9%(w/v)氯化鈉。
10. 1/15mol/L、PH7.7磷酸緩沖液
（A液）1/15mol/L Na2HPO4溶液：稱取Na2HPO4·2H2O1.187g，將之溶解于100ml蒸餾水中即成。
（B液）1/15mol/L KH2PO4溶液：稱取KH2PO40.9078g，將之溶解于100ml蒸餾水將之溶解，最后定容至100ml。
取A液90 ml、B液10 B液，將兩者混合即可。
主要設備
1. 勻漿器（或攪拌機）
2. 碘量瓶。
實驗材料
動物活體
實驗步驟
1．肝勻漿的制備
1) 將動物（如雞、家兔、大鼠或豚鼠等）放血處死，取出肝臟。
2) 用0.9%氯化鈉溶液洗去肝臟上的污血，然后用濾紙吸去表面的水分。溶液至總體積為10ml。
2．酮體生成
1) 取兩個錐形瓶，編號，按下表操作。
錐形瓶試劑（ml） | A | B |
新鮮肝勻漿 | — | 2.0 |
預先煮沸的肝勻漿 | 2.0 | — |
PH7.7 的磷酸緩沖液 | 3.0 | 3.0 |
0.5mol/L正丁酸溶液 | 2.0 | 2.0 |
2) 將加好試劑的2個錐形瓶搖勻，放入43℃恒溫水浴鍋中保溫40min后取出。
3) 于2個錐形瓶分別加入20%三氯乙酸溶液[注2]3ml，搖勻后，于室溫放置10min。
4) 將錐形瓶中的混合物分別用濾紙在漏斗上過濾，收集無蛋白濾液于事先編號A、B的試管中。
3．酮體的測定
1) 取碘量瓶[注3]2個，根據上述編號順序按下表操作。
碘量瓶編號試劑（ml） | A | B |
無蛋白濾液 | 5.0 | 5.0 |
0.1mol/L碘液 | 3.0 | 3.0 |
10%NaOH | 3.0 | 3.0 |
2) 加完試劑后搖勻，將碘量瓶于室溫放置10min。
3) 于各碘量瓶分別滴加10%鹽酸溶液，使各瓶中溶液中和到中性或微酸性（可用PH試紙進行檢測）。
4) 用0.02mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定到碘量瓶中的溶液呈淺黃色時，往瓶中滴加數滴0.1%淀粉溶液，使瓶中溶液呈藍色。
5) 繼續用0.02mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定到碘量瓶中溶液的藍色消褪為止。
6) 記錄下滴定時所用去的硫代硫酸鈉溶液毫升數，按下式計算樣品中丙酮的生成量。
4．結果與計算
根據滴定樣品與對照所消耗的硫代硫鈉溶液體積之差，可以計算由丁酸氧化生成丙酮的量。
實驗中所用肝勻漿中生成丙酮的量（mol）=（A－B）×C×1/6
A：為滴定樣品A（對照）所消耗的0.02mol/L硫代硫酸鈉溶液的毫升數。
B：不滴定樣品B所消耗的0.02mol/L硫代硫酸鈉溶液的毫升數。
C：硫代硫酸鈉溶液的濃度（mol/L）
注意事項
1. 肝勻漿必須新鮮，放置久則失去氧化脂肪酸能力。
2. 三氯乙酸作用是使肝勻漿的蛋白質、酶變性，發生沉淀。
3. 碘量瓶作用是防止碘液揮發，不能用錐形瓶代替。
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