蘇云金桿菌的血清學鑒定

一、目的：

1、學習抗原  及抗體的制備方法

2、學習試管凝集反應的方法及效價的測定

3、學會分析不同抗原（o抗原、H抗原）的方法

二、實驗原理

將生物細胞或它們的磨碎物。提取物等注射到熱血動物體內，動物血液中可以產生與注射物起作用的物質——抗體。能誘發抗體產生的注射物稱為抗原。含有抗體的血清稱為免疫  血清或抗血清。抗原和抗體之間會發生各種血清學反應，如凝集反應，沉淀反應等，它既專化又敏感，可用于鑒定和研究細菌等生物的親緣關系。

三、實驗器材及藥品

1 U形管，試管 2 半固體培養基、肉湯培養基 3 接種環 4 高壓鍋 5 搖床 6 顯微鏡 7 離心機  8 0.25%甲醛生理鹽水等

四、實驗內容

1、 制備H-抗原

（1）制備半固體培養基：成份：牛肉膏1%，蛋白胨1%，瓊脂0.4%，把半固體培養基裝入裝有U形玻璃管的試管中，15磅滅菌30min。

（2）活化菌種：將菌種接在盛有半固體培養基的U形管一端，一天后發現菌株運動到另一端后迅速取出，轉接于第二支U形管中，如此3-5次。

（3）搖床培養：從最后一次活化管中取運動性最強的菌株接入500nl成有肉湯培養基的搖瓶內，每瓶含100ml培養基，其成份為：牛肉膏1%，蛋白胨1%，水100ml。每瓶接上一接種環，稍弄散，避免集中，放入30度搖床振蕩培養9-10小時。

（4）無菌檢查及離心：取出培養液，涂片，用苯酚品紅染色，顯微鏡油鏡檢查，若無其他雜菌時，裝入離心管3000轉/分離心15-20分鐘。倒去生理鹽水，收集沉淀懸浮于0.25%甲醛生理鹽水中。每塑料管用10ml甲醛生理鹽水洗下裝入試管，置冰箱待用。

（5）制備抗體：實驗室中制備抗血清都用家免，大量生產則用馬等。

i. 動物的準備：免疫注射采用體重2-3公斤的健康雄免。把免子固定在特制的木盆內，只留頭部在外，將雙耳邊緣附近的毛用刀片剃去，用75%酒精消毒，再用少量二甲苯試去耳翼使靜脈充血，取血少量，測定注射前的正常血清能否與測定的細菌發生凝集反應。如不進行了凝集反應，則可用來作免疫注射。

ii. 免疫注射：抗原嘗試采用麥氏比色管第7管，采用5號針頭注射。注射方案如下：第1天0.5ml，第3天1ml，第5天1.5ml，第2天ml，第9天2.5ml。再過6天后進行試血，當效價達2000左右時，即可大量采血。若效價太低，可繼續補充注射。

iii. 兔子放血：先把兔子固定在小動物解剖臺上，剪去頸部毛和頸部皮膚，直至現出食管為止。仔細在食管兩側稍靠下部找也左右兩根頸動脈，用線綁住附近頭端，再用止血鉗鉗住，在細線與止血鉗間用剪刀剪斷，再在兩鉗音剪斷，動脈血就噴出，可用三角瓶接收。若要采用心臟取血法，則用9號注射針頭對準家免以及跳動最激烈之筋骨刺入，進行抽血。

iv. 抗血清處理：室溫下使血液凝固，分出血清，并進行了離心后再加1/10000硫柳汞置冰箱保存。最好把血清盛放在安培瓶中封口，貼上標簽，置冰箱保存。

3． 效價測定：用一種抗原與一種抗血清反應

（1）取14根小試管在試管架上成一排

（2）用移液管加入生理鹽水，第一管0.9ml，其余0.5ml。

（3）用移液管吸0.1ml抗血清于第一管，使之成1ml，再用另一支移液管從第一管吸0.5ml至第二管，一直類推至第13管。再從第13管吸也0.5ml去掉，第14管作為對照。