熒光定量PCR應用——腫瘤篇

   腫瘤是是機體在各種致癌因素作用下，局部組織細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，從而導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學界將其分為良性和惡性兩大類。腫瘤作為全球疾病致死的重要元兇之一，如果發現和治療不及時，有可能導致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發熱及臟器功能受損等，其后果極為嚴重。

    實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）技術是在PCR技術的基礎上發展起來的核酸定量技術，是1996年美國Applied Biosystems公司推出，它是通過在PCR反應體系中加入熒光基團，然后利用熒光信號的積累強弱實時監測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知的DNA模板進行定量，實現了PCR從定性到定量的飛躍，為全面快速準確地分析樣本中的各類待檢物質提供了嶄新的技術工具，現在已被廣泛應用于實驗室及臨床腫瘤標志物的檢測。

    Real-Time PCR與傳統的PCR技術相比其使用了熒光探針標記特定核酸從而提高了準確性；靈敏度提高故使用較少的樣本量，從而減少了樣本消耗殆盡的風險，在一小時左右即可出結果，簡化了傳統PCR方法；全封閉管分析、利用電腦分析軟件對PCR擴增產物的實時動態的檢測和自動定量，定量動態范圍高達五個數量級，且結果重現性較好，這也提高了檢測的靈敏度和精密度。

Real-Time PCR在腫瘤檢測與治療方面的應用：

• 早期診斷、分型

    卵巢癌是婦科死亡率zui高的惡性腫瘤，其具有發病隱匿，進展迅速的特點，僅有25%的卵巢癌能在Ⅰ期病變時被發現，大多數的患者診斷時都已擴散或轉移，故卵巢癌的早期診斷對于卵巢癌患者具有重要作用。人附睪蛋白4（HE4）是近年來發現的一個新基因，大量的研究表明HE4是一個優秀的鑒別卵巢良惡性病變的生物標志物，研究人員采用Real-Time PCR技術進行檢測，發現晚期卵巢癌經過手術和治療，在復發前4~5個月就有HE4升高現象，提示HE4可用于檢測卵巢癌復發。

    許多研究者認為乳腺癌是一種全身性疾病的局部表現，其治療效果的好壞取決于確診時是否遠處轉移。轉移和復發是乳腺癌致死的主要原因，如果可以在亞臨床狀態就能檢測到微轉移，對臨床的診斷、治療及患者的預后都具有重要的指導性作用。早期乳腺癌復發轉移的預測與防治是乳腺癌研究的前沿課題，尤其是外周血循環腫瘤細胞(CTT)及腋窩淋巴結微轉移的檢測逐漸成為乳腺癌研究的重點。其中常見的標志性蛋白有乳腺上皮小黏蛋白（SBEM）、細胞角蛋白19（CK19）及乳腺株細胞（hMAM）等。

    經研究表明，miR-122與肝細胞癌分型密切，miR-122表達受抑制是肝癌的特征，其主要表現為侵襲能力增強、腫瘤復發和患者生存時間減少；采用Real-Time PCR技術同時聯合免疫組化等方法對miR-122表達的檢測對于肝細胞癌的分型判斷具有重要作用。

• 判斷預后

    熒光定量Real-Time PCR技術主要通過檢測化療過程中外周血中腫瘤靶mRNA的動態變化來對化療敏感性進行評估。化療后CK19mRNA表達陽性的病人臨床復發及病死率明顯增高(P<0.001), 而無瘤生存期及總體生存率明顯降低(P<0.001)。統計分析表明:熒光定量Real-Time PCR檢測化療前后外周血中CK19mRNA表達水平可作為判斷乳腺癌病人預后及總體生存率的獨立指標。

    研究發現對于miR-429來說，高miR-429表達與肝癌的不良預后相關。近年來也有越來越多的證據表明miR-429的表達與多種腫瘤相關，如結腸癌、胃癌、卵巢癌。

• 指導治療

    傳統的臨床評定化療敏感性方法主要是根據腫瘤的大小變化， 需要在開始治療之后3 ～ 4mo進行。而通過檢測腫瘤化療過程中外周血中靶mRNA的動態變化可以在zui初治療之后3 ～ 4wk盡早預測療效, 這對于決定病人的個體化治療具有重要意義, 尤其對于非實體瘤以及輔助化療病人, 由于沒有可測量的實體病灶, 此種評估化療敏感性的方法顯得尤為重要。

    綜上所述，Real-Time PCR 是在臨床上廣泛應用的一種基因定量檢測技術, 它不但能夠準確定量腫瘤相關基因的表達量, 還可以對外周血中腫瘤標志物進行準確定量, 據此可以對腫瘤早期診斷, 腫瘤分期、分型,對腫瘤轉移的早期發現及預后判斷。但是我們也看到，Real-Time PCR檢測存在假陽性和假陰性等問題，但相信隨著科技的進步，采用Real-Time PCR技術對多個基因進行聯合檢測，進行綜合性指標分析，或與其他一些技術諸如反轉錄PCR技術、免疫組化法、HE染色法等的結合應用，使得Real-Time PCR技術在臨床及更多領域上將有更加廣闊的應用前景。