蛋白質一級結構的測定方法（一）

   研究蛋白質的一級結構從確定組成蛋白質的單元結構棗氨基酸算起，已有150年的悠久歷史，直到1955年，Sanger首次闡明胰島素的氨基酸排列順序，為研究蛋白質的一級結構開辟了道路。這在分子生物學的發展進程中是一個重要突破。目前關于核酸的一級結構研究，由于Sanger等發明了加減法，可以得到了突飛猛進的發展。對此之下，關于蛋白質的一級結構研究進展不如核酸迅速。但隨著Edman液相自動順序分析儀和固相順序分析儀以及氣相色譜質譜(GCMS)等方法的相繼出現。使結構分析的速度也顯著加快。至今已完成近千種蛋白質的一級結構分析。目前不僅樣品用量減少，而且工作人員也大大減少。當年Sanger分析胰島素用了整整十年的時間，今天運用自動化儀器，分析一個分子量在10萬左右的蛋白質只需要幾天，可見新技術的應用和發展對科學發展起的促進作用，蛋白質一級結構測定方法的綜述及專著文獻較多，這里只扼要加以概述。

　　蛋白質分子的一級結構測定，概括起來包含多肽鏈的分離、降解、肽段的分離和順序分析以及－S－S－定位等。

　　一級結構的測定方法可概述如下：

　　1.多肽鏈的分離

　　在測定一個蛋白質的結構以前，首先必須保證被測蛋白質的純度，使結果準確可靠。其次要了解它的分子量和亞基數，按照其亞基數將蛋白質分成幾個多肽鏈。

　　1)肽鏈的拆開

　　蛋白質分子多肽鏈的連接有共價結合和非共價結合兩種。要拆開以共價結合的-S-S-連接的多肽鏈，必須采用的化學處理方法常有：

　　①過甲酸氧化

　　用氧化劑過甲酸斷裂-S-S-。這個反應一般在0℃下進行2小時左右，兩個S就全部能轉變成磺酸基，這樣被氧化的半胱氨酸稱為磺基丙氨酸。

　　如果蛋白質分子中同時存在半胱胺酸，那么也會被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，從而增加分析的復雜性。

　　②巰基乙醇還原

　　利用還原劑巰基乙醇亦可使蛋白質的-S-S-斷裂。當高濃度的巰基乙醇在pH8?條件下室溫保溫幾小時后，可以使-S-S-定量還原為桽H。與此同時反應系統中還需要有8摩爾脲或6摩爾鹽酸胍使蛋白質變性，多肽鏈松散成為無規則的構型，此時還原劑就可作用于-S-S-。此反應是可逆的，因此要使反應完全，疏基乙醇的濃度必需在0.1-0.5摩爾。

　　③Cleland試劑的還原作用

　　Cleland′s指出二硫赤蘇糖醇(dithioerythriotol)及二硫蘇糖醇(dithiothriotol)在氧化還原能力上是比較強的試劑，只要0.01摩爾就能使蛋白質的-S-S-還原，反應基本與疏基乙醇相似，且在許多球蛋白反應中，可以不用變性劑。

　　Cleland試劑首先與蛋白質-S-S-形成中間物，反應終了，還原劑被氧化形成一個穩定的六環化合物，蛋白質則被還原。

　　還原蛋白不穩定，SH基極易氧化重新生成-S-S-鍵。穩定SH基的方法有：

　　(A)烷基化試劑使SH基轉變為穩定的硫醚衍生物。

　　如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸，其產物S羧氨甲基衍生物不帶電荷，磺代乙酸也可與組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸發生反應，但反應條件不同，可通過各種pH及反應時間進行控制。

　　(B)氨乙基化

　　蛋白質分子的幾條肽鏈若以非共價健結合，則用尿素、鹽酸胍等變性劑即可拆開。蛋白質的多肽鏈被拆開后，將它分離純化，一般多用凝膠過濾、離子交換、電泳等方法，茲不贅述。

　　分離純化后的每條肽鏈還要進一步分析其末端。