可能原因 | 驗證或解決辦法 |
|---|---|
抗體結合不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
酶失活 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 |
標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 |
試劑不匹配 | 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性 |
一抗失效 | 選擇在有效期內的抗體；并選擇現配現用的工作液 |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 |
膜沒有完全均勻濕透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
靶蛋白分子質量小于10kD | 選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間 |
轉移時間不夠 | 對于厚的膠以及高分子量蛋白質需要延長轉移時間 |
抗體活性降低 | 選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置 |
封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型 |
曝光時間過短 | 延長曝光時間 |