蛋白質含量測定實驗——考馬斯亮藍法

蛋白質樣品

牛血清NaCl考馬斯亮藍

分光光度計離心機

一、試劑與器材
 

1.  試劑
 

（1） 標準蛋白質溶液，用 G-球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0 mg/ml和0.1 mg/ml的標準蛋白質溶液。
 

（2） 考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100 mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸，用水稀釋至1 L。

2.  器材
 

 可見光分光光度計、 旋渦混合器、 試管16支。
 

二、操作方法
 

1.  標準方法

（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0 mg/ml的標準蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 ml，然后用無離子水補充到0.1 ml。最后各試管中分別加入5.0 ml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。

（2） 加完試劑2-5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A595，空白對照為第1號試管，即0.1 ml H₂O加5.0 ml G-250試劑。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。
 

考馬斯亮蘭法實驗表

（3）用標準蛋白質量（mg）為橫座標，用吸光度值A₅₉₅為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據測出的未知樣品的A₅₉₅值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。
 

0.5 mg牛血清蛋白/ml溶液的A₅₉₅約為0.50。
 

2. 微量法
 

當樣品中蛋白質濃度較稀時（10-100 mg/ml），可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5 ml或1.0 ml，空白對照則分別為0.5 ml或1.0 ml H₂O， 考馬斯亮藍G-250試劑仍加5.0 ml，同時作相應的標準曲線，測定595 nm的光吸收值。
 

0.05 mg牛血清蛋白/ml溶液的A₅₉₅約為0.29。

Bradford法比Lowry法要簡單迅速，是測定蛋白質濃度的選用方法。有些物質會干擾這種檢測反應，它們是甘油、去污劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、和一些堿性緩沖系統。用脫氧膽酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除大部分這些干擾物質的影響。

一、bradford法的突出優點
 

1.  靈敏度高，據估計比lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1 mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比lowry法要大的多。
 

2.  測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
 

3. 干擾物質少。如干擾lowry法的K⁺、Na⁺、Mg²⁺離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
 

二、bradford法的缺點

1.  由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用 G-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
 

2.  仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Ttriton x-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1 N的氫氧化鈉。（如同0.1 N的酸干擾lowary法一樣）。
 

3.  標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。