蛋白質沉淀技術

一、AS 沉淀

1.原理

雖然有些其他鹽類也可以用做沉淀劑，但是 AS 的特點突出，故而最具有應用價值。

AS 可很好地穩定蛋白質的結構、可溶性極好、相對價廉、純物質容易獲得，且 25℃ 時其飽和溶液的密度 (4.1InoVU1O=I.235 g/cm3) 低于另一種鹽析劑磷酸氫二鉀（3mol/L，(0=1.33 g/cm3)。

圖 20.1 所示為典型的蛋白質溶解度曲線，是以蛋白質溶解度的對數對應 AS 濃度函數繪制而成。該曲線的特征是，在鹽濃度較低的區域蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而增大 (稱為「鹽溶」），而在鹽濃度較高的區域蛋白質的溶解度隨鹽濃度升高而減小 (稱為「鹽析」）。該曲線后半部分可以通過等式 l 〇 g1DS=|3—Ks(r/2) 來描述。其中，S 為蛋白質在溶液中的溶解度，以 mg/mL 表示; 廠/2 為離子強度;j3 和 K3 為所涉及的蛋白質的特征常量。Ks 為鹽析曲線的斜率, 而卩為鹽析曲線外延至離子強度為〇時的蛋白質溶解度的對數值。一般地, 大多數蛋白質均具有相似的民值，而 p 值卻有很大的區別。

假設圖 20.1 所示曲線適用于目標蛋白質，并且其在細胞提取物中的濃度為 Img/mL。

最上方的水平虛線與溶解曲線交叉點為 logS=0(s=lmg/mL) 時 AS 的百分飽和度為 26%。這意味著若將 AS 增加到 26% 飽和度，所用的目標蛋白質都會溶解。若將 AS 增加到 32% 飽和度 (中間的水平虛線），l 〇 gS=_1(S=0.1 mg/mL), 將有 90% 的目標蛋白質會變得不可溶而析出。對于這種提取方法，一種較好的策略就是使 AS 達到 26%?

32% 的百分飽和度: 首先，使 AS 的百分飽和度達到 26%，選擇分離出不溶性的物質，之后提高 AS 飽和度至 32%，并收集沉淀物，其中會含有 90% 的目標蛋白質。對于那些飽和度 26% 時沉淀以及在飽和度 32% 時無法沉淀的雜質蛋白質和細胞組分，可以通過沉淀去除。

建議考慮采用緩沖液將提取物稀釋 1 〇倍。此時，目標蛋白質在提取物中的初始濃度為 0.Img/mL 或 logS=—l。提高 AS 的飽和度到 32%，目標蛋白質不會發生沉淀。為了獲得 90% 目標蛋白質沉淀，應該提高 AS 的飽和度至 38%(下方的水平虛線) 或者采取 32%?38% 的 AS 飽和度區間。最終可能不得不將提取物稀釋后，使用超過之前 10 倍量的 AS 來獲取目標蛋白質。這說明限定提取物濃度是十分重要的。

目標蛋白質不一定具有如圖 20.1 所示的溶解曲線，所以必須先進行下文所述實驗確定適宜的 AS 濃度。

2.基本操作程序

在 AS 的應用方面有多種不同的操作方法，最常見的是向蛋白質提取液中加人固體 AS 以達到所需的百分飽和度。參考表 20.1 加人固體 AS 很方便, 且具有可重現性和實用性。

(1) 一般在較低百分飽和度時，目標蛋白質不會發生沉淀，而在較髙百分飽和度時會有 90% 以上的蛋白質析出。

(2) 加人固體 AS 以達到較低百分飽和度。高速攪拌的同時小心緩慢地加人 AS, 這樣可以避免局部濃度超過目標值。有些人會采用研缽和研棒細心地將固體 AS 研磨成細粉狀，以使其可以快速溶解。一旦 AS 全部溶解，就可以使沉淀持續 30 min 左右。這是一種折中的方法，既可以等待數小時使沉淀緩慢達到平衡, 同時又可以與純化過程同步進行，并且不延誤進程。通常應在一個小冰桶或冷室內進行所有的操作。

(3) 在一個預冷的旋轉器中, 設置為 10000 心離心 10 min，以去除不溶性物質。

(4) 小心倒出上清液，并測量其體積。依據表 20.1 所示的以百分飽和度從低到高的順序加入 AS 以確定所需 AS 的質量。繼續伴以快速的攪拌并緩慢加入 AS，以避免局部形成較高鹽濃度，之后靜置 30 min, 使其形成沉淀。

(5) 如步驟 (3) 中所示進行離心。盡量去除上清液, 若之前已經仔細地進行了沉淀的預實驗，則沉淀中會含有 90% 或更多的目標蛋白質。該蛋白質可溶解于適宜的緩沖液中，經過透析、脫鹽和稀釋后，便可用于下一步的純化操作。

3.AS 沉淀實驗的實施

一般地，提高 10% 的 AS 飽和度可以使 90% 目標蛋白質發生沉淀, 所以我們應該限制「AS 區間」的范圍, 使其不超過 1 〇%(如蛋白質剛好在 30% 的飽和度溶解，但是在 40% 飽和度時發生沉淀，將此稱為 30%?40% 的 AS 區間）。

如圖 20.2 所示方法，僅采用兩步離心操作便可以確定最佳 AS 沉淀條件。基本上，首先將細胞提取物置于一個容器中，如取 10 mL 樣品分別加入到 5 個離心管中。依據表 20.1 向離心管中分別加人固體 AS, 使其飽和度分別達到 20%、30%、4 〇%、50% 和 6 〇%，靜置 30 min 使蛋白質沉淀, 接著離心去除不溶性的物質。沉淀即分別為 20%、30%、40%、50% 和 60% 飽和度 AS 沉淀。測定相應上清液的體積，并再次加入 AS, 分別提高 10% 的飽和度。繼續混勻后，使溶液靜置 30 min, 待其沉淀后離心。所得的 5 份沉淀即為 20%?30%、30%?40%、40%?50%、50%?60% 和 60%?70% 的 AS 區間。再將其分別溶解于緩沖液，進行酶活力和總蛋白質含量的分析，必要時也可進行 SDS 凝膠分析。

仍具有活力的大多數蛋白質的大多數活力應在其中一個區間中。例如，30%?40% 區間活力為一半，40%?50% 區間活力為一半，那么 35%~45% 區間可能會是最佳 AS 濃度范圍。雖然這種實驗看起來顯得比較縶瑣，但是在沉淀步驟中確定可以富集更多蛋白質的最佳條件時，這無疑是一種十分有效的方法。

4.說明、問題、解決方法

(1) 得到的沉淀并不結實在離心之后，若 AS 沉淀形成得不結實，那么將很難將上清液完全傾出。一個簡單的解決方法是將離心時間延長 50%，那么在離心管底部的沉淀物將會有更多的時間變得致密。松散沉淀物形成的另一個原因是其中存在 DNA，它增加了溶液的黏度，從而降低沉淀形成的速率。如是黏度的問題，一個方法是可通過更長時間的超聲處理來破碎細胞, 使 DNA 被剪切成更短的片段來解決; 另一個方法是采用重組的核酸酶 Benzonase(EMD/Novagen) 進行處理。

(2) 在高濃度 AS 中形成球狀懸浮物因為較髙濃度 AS 的密度與蛋白質聚集體的密度相當，所以通過離心處理后,AS 沉淀物可能會以懸浮物的形式存在，而不是以沉淀的形式存在于離心管底部。這很可能是因為蛋白質中含有部分脂類或者周圍存在一些非離子化的去污劑與蛋白質結合使其密度降低。

(3) 很難按照已經發表的方案進行操作許多已經發表的方案并不是按照既定 AS 飽和度（在 0°C、20°C 或 25°C 時的飽和度) 或提取物的蛋白質濃度來進行的。因此需要注意的是，沉淀所需的 AS 量取決于蛋白質的濃度。

(4) 不得不中斷 AS 沉淀步驟若須停止沉淀，可以將蛋白質保留在 AS 沉淀中。蛋白質在 AS 中是十分穩定的，析出蛋白質的懸液或沉淀都是如此。

二、PEI 沉淀

1.原理

PEI，其商品名稱為聚乙烯亞胺 (polyminP)，它是由巴斯夫 (BASF) 生產的一種堿性陽離子聚合物，大量地用于紡織和造紙工業中。PEI 是通過乙烯亞胺的聚合作用得到的堿性多聚體，其結構為:CH3CH2N—(-CH2CH2—NH—X-CH2CH2NH2。經典 W 值為 700?2000, 相應所得到聚合物的分子質量為 30OOO?90OOODa。因亞氨基的 pKa 值為 10?11，所以在中性 pH 溶液中 PEI 帶正電荷。采用;PEI 進行蛋白質分離起源于 Boe-hringerMannheim，Zillig 等 (1970) 進行了相關報道。將其用于蛋白質純化的更多實例可參見幾篇已發表的綜述 (Burgess,1991;BurgessandJendrisak,1975;Jendrisak，1987;JendrisakandBurgess,1975)0 可以認為 PEI 類似于可溶的 DEAE 纖維素。PEI 可結合于帶負電荷的大分子，如核酸和酸性蛋白質，進而形成 PEI 的網狀結構，隨后結合的酸性分子會快速形成沉淀。這種結合是以化學計量的方式進行的。較重的沉淀可以快速地形成，并可通過 5000r/min 離心 5 min 收集。酸性蛋白質是否可與 PEI 結合取決于鹽溶液的濃度。在較低鹽濃度 (0.Imol/LNaCD 時，微酸性的蛋白質會與 PEI 結合并形成沉淀，但是在中等鹽濃度 (0.4mol/LNaCl)，它可以從多聚體上被洗脫下來，變得可溶。強酸性蛋白質在低鹽濃度中會與 PEI 結合，但在中等濃度不會溶解，高鹽濃度 (〇.9m 〇 l/LNaCl) 時才能被洗脫下來。應該注意的是，當蛋白質從 PEI 顆粒中被洗脫下來時，蛋白質和 PEI 本身都會變得可溶。所以, 在返回到低鹽濃度前，需要將 PEI 從蛋白質中去除（參見本章 3.2?3.5 節)。

2.PEI 的不同使用方式

存在以下 3 種不同的 PEI 沉淀使用策略。

策略 A: 在高鹽濃度 (Imol/LNaCl) 采用 PEI 沉淀。該方法會沉淀核酸, 同時幾乎所有的蛋白質留存于上清液中。

策略 B(對于中性或堿性蛋白質而言）: 在〇.Im 〇 l/LNaCl 的條件下采用 PEI 沉淀，可去除核酸和酸性蛋白質。同時目標蛋白質留存于上清液中。

策略 C(對于酸性蛋白質，如 RNA 聚合酶): 這種方案將會在下文中進行詳細的討論，它是以 Burgess 和 Jendrisak(1975) 的方法為基礎，并由 Burgess 和 Knuth(1996) 改善。

3.策略 C 的基本操作程序

(1) 配制 10%(V/V)[5%(m/V)] 的 PEI 儲存液。PEI(WV) 常以 50%(m/V) 的黏稠液體狀態存在（來自于 MPBiochemicals 的 PEI, 其相對分子質量 Mw=50000?

100000, 也可采用其他來源，如 Sigma 和 Aldrich，Mw=750000)。取 10 mLPEI, 用雙蒸水 H2O 稀釋至 70 mL，并以濃鹽酸 (3.8?4.0 mL) 調節 pH 至 7.9。最后以雙蒸水 H2O 定容至終體積為 1 〇〇 niL。儲存液在冷室或室溫下是穩定的。應該注意的是, 有些公司提供的 PEI 溶液已經用雙蒸水 H2O 進行 I:1 稀釋, 以降低溶液的黏稠度, 有利于溶液的配制。其濃度僅為 25%(m/\〇。

(2) 在 30 mL 含有 50 mmol/LTris-Ha(pH7.9)、5% 甘油、0.1 mmol/LEDTA、0.Immol/LDTT 和 0.15mol/LNaCl 的緩沖液中通過超聲破碎?.cW 細胞 (約 3 g 的細胞沉淀物）。再以 15000r/min 離心 15 min 去除細胞碎片。所有的操作均在冰浴中進行。

(3) 將 PEI 沉淀實驗應用于具體的體系 (如下所述)。例如, 加人 pH7.910%(V/V)PEI，使其終濃度為 0?3%(V/V)，混合 5 min, 直到形成稠密的白色沉淀物。

(4)5000r/min 離心 5 min。注意: 不要離心太實, 否則沉淀不易重懸。將〇.3% 的 PEI 上清液棄去，保存用于下面的分析。干燥沉淀物 1?2 min，盡量去掉殘留的上清液。

(5) 用上述含有〇.4mol/LNaCl 的緩沖液 30 mL, 充分重懸 0?3%PEI 沉淀物。如果條件允許，可以采用 TissueTearor 勻漿器（BioSpecProducts,Inc.Cat#985370-07)，它可以很好地重懸沉淀物，有效地以物理形式洗掉陷入沉淀內的蛋白質，并洗脫與沉淀物 PEI 結合較弱的微酸性蛋白質。靜置 5 min，接著以 5000r/min 離心 5 min，并傾出 0.4mol/LNaCl 的緩沖液。

(6) 用上述含有〇?9mol/LNaCl 的緩沖液 30 mL, 充分重懸 0?4mol/LNaCl 沉淀物。這種洗脫液中含有更多的酸性蛋白質 (如 RNA 聚合酶），但同時會使核酸留存于沉淀物中 (可采用 I.6md/LNaCl 洗去核酸)。靜置約 5 min，混勻后以 15000r/min 離心 10 min。

(7)0.9mol/LNaCl 的洗脫液，需加入固體 AS 使其飽和度達到 60%(每 10 mL 加人 3.61 g)。持續混合至少 30 min 形成沉淀。以 15000r/min 離心 10 min。使沉淀物去水 5 min。該沉淀物中含有 AS 沉淀的蛋白質，而幾乎所有的 PEI 都會留存于上清液中。但還是會有微量的 PEI 陷入到沉淀物中，通常不會影響下面的操作。如有必要更徹底地去除這些微量的 PEI，可以采用含有 60% 飽和度 AS 的緩沖液重懸該沉淀物，并再次離心。

這種操作程序一般可以使 RNA 聚合酶從其他蛋白質中得到 6 倍純化，回收率大于 90%，在 1?2 h 內可去除幾乎所有的核酸。

補充說明

⑴需著重強調的是, 從 0.9mol/LNaCl 洗脫液中去除 PEI 是必要的。如果僅采用稀釋或透析的方法達到低鹽濃度，蛋白質還是會與 PEI 結合, 并再次發生沉淀。

⑵我們發現，即使存在 1% 的 TritonX-100，PEI 沉淀還是會發生。

(3) 與 AS 沉淀不同，當用緩沖液 10 倍稀釋提取物時，需要加人同樣量的 PEI(如對于正常的提取物，用〇.3% 的 PEI 可以很好地沉淀目標蛋白質，而對于 1 〇倍稀釋的提取物，僅需要加入〇.03% 的 PEI，便可以達到相同的沉淀效果，當然，所用的體積為提取物的 10 倍)。這表明 PEI 可以緊密地結合酸性組分，本質上即為對其進行滴定。

4.PEI 沉淀實驗的實施

既然我們不能預測需要多少量的 PEI 才能沉淀某一酸性蛋白質，或者需要采用多大濃度的鹽將蛋白質從 PEI 上洗脫下來，那么，建議還是先進行簡單的 PEI 沉淀和洗脫實驗 (BurgessandJendrisak,1975;BurgessandKnuth，1996)。基本上，該實驗的步驟如下所述。將 6 個 200 樣品分別裝于 6 個微量離心管, 再加入 10%(VAZ) 的 PEI, 使其終濃度分別達到〇%、〇.l%、〇.2%、0.3%、0.4% 和 0?5%(V/V)。高速混合微量離心管 Imin。進行上清液的酶活性或 SDS 凝膠電泳分析, 如有需要, 還可采用 WesternBlot 檢測沉淀所有目標蛋白質所需最小量的 PEI。我們假設其為 0.3%。接著，如上所述準備 6 個微量離心管，且每個離心管中均含有少量的 0.3%PEI 沉淀物，再加人 200JL1L 含有 0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L 和 I.0mol/LNaCl 的緩沖液。

充分重懸。靜置 15 min，離心，如上所述分析上清液中的目標蛋白質。將不能洗脫任何蛋白質的最高鹽濃度溶液作為清洗液，將可以洗脫所有目標蛋白質的鹽濃度溶液作為洗脫液。

3.5 實例：采用 PEI 沉淀與 DNA 結合的堿性蛋白質最近，有研究者 (DuellmanandBurgess，2008) 設法純化由 coZi 表達的強堿性蛋白質，愛潑斯坦-巴爾病毒核抗原 (Epstein-Barrvirusnuclearantigen1，EBNA1)。我們在 0.1mol/LNaCl 的條件下，進行了 PEI 沉淀實驗，以研究是否可以沉淀核酸和酸性蛋白質, 并將堿性的 EBNAl 留存于上清液中（采用策略 B)。意外的是，當加入少許 PEI(0.15%)，EBNA1 可以沉淀，但是當加人更多的 PEKO.4%) 卻不能沉淀 EBNA1。這表明 EBNAl 與 DNA 已經結合，繼而與 DNA—起被沉淀。但是，在更髙濃度的 PEI 存在時，PEI 會優先與 DNA 結合, 并置換出 EBNAl。我們發現，可以采用 0.15% 的 PEI 進行沉淀，0.3mol/LNaCl 進行清洗,0_8mol/LNaCl 進行洗脫。這樣能夠在使 EBNAl 得到很好富集的同時，還可以快速地去除核酸。

三、其他方法

本章已經著重討論過 AS 沉淀和 PEI 沉淀。下述內容將會簡單地論述用于蛋白質沉淀的其他方法，大量文獻已詳細描述了這些方法 [見 Englard 和 Seifter(1990);Ingham(1990)；Scopes(1994)]。

1.乙醇和丙酮沉淀

采用有機溶劑，如乙醇和丙酮進行沉淀處理，該方法已經有超過 100年的使用歷史，但是最為大眾所熟知的是 Cohen 和 Edsall 的經典研究成果，他們將其用于人血清蛋白質的分離。該沉淀方法的操作必須在較低的溫度下進行，以避免蛋白質變性。

2.等電點沉淀

蛋白質在其等電點會變得不可溶，此時，它帶有的凈電荷為〇，且蛋白質分子之間的電荷排斥力相對最小，因而相互之間能夠很容易地靠近。蛋白質在很低的離子強度下不易溶解，那么同樣也可以在很低的鹽濃度或無鹽時進行等電點沉淀操作。

3.熱沉淀

本方法中，將細胞提取物加熱到一定的溫度，此時許多蛋白質會發生變性而沉淀，但目標蛋白質因其更穩定仍會保持可溶性狀態。該方法尤其可用于純化表達的嗜熱菌酶類，具體的操作可將細胞提取物加熱到足夠高的溫度，使幾乎所有的?：? 〇^蛋白質變性沉淀，而將熱穩定的酶留存于溶液中。

4.聚乙二醇（非離子型聚合物）沉淀

本方法可參見 Ingham(1990) 的綜述。

四、沉淀分離蛋白質的常規操作

(1) 在清洗或洗脫階段，充分重懸蛋白質沉淀是十分重要的。雖然沉淀看起來十分結實, 但仍有大量的上清液陷人其中，且會附著于離心管的管壁。如之前所提到的一樣，盡量干燥沉淀物以除去其中存在的上清液。如果沉淀比上清液量大，建議采用 10 倍體積的適宜緩沖液進行重懸，以去除陷人到沉淀物中的上清液蛋白質。例如，用 40% 飽和度的 AS 進行沉淀時，可采用 40% 飽和度 AS 重懸沉淀然后再次離心。清洗 PEI 沉淀是一個非常有用的步驟, 推薦采用與 TissueTearor 類似的勻漿器，可以將沉淀打碎并形成均勻的懸浮液。如果重懸不充分, 那么清洗步驟將不能起到有效的去除核酸的效果，且分離作用也會相應降低。

(2) 混合時應避免泡沫形成。若有空氣混入蛋白質溶液中會促進蛋白質的氧化，同時在空氣-水界面可引起蛋白質的變性。