超凈工作臺人胎盤間充質干細胞的分離與鑒定實驗流程

 實驗材料

1. 1. 1 主要儀器及試劑倒置顯微鏡( Olympus，日本) ，二氧化碳培養箱( Thermo，美國) ，超凈工作臺( 博科生物) ，移液器( Eppendorf，德國) ，染色體核型分系統( Cytovision，AI，UK) ，流式細胞儀( BD，美國) ，胎牛血清( FBS，Gibco) ，L － DMEM( Invitrogen) ，青/鏈霉素，Antibiotic( Invitrogen) ， IV型膠原酶( Collagenase IV，Gibco ) ，Dispase Ⅱ( Roche) ，L － 谷氨酰胺( Invitrogen) ，鼠抗人單克隆抗體IgG2a － FITC， IgG1 － PE，CD29 － PE，CD34 －PE，CD44 － FITC，CD105 － FITC( 均為BD 公司生產) ，植物細胞凝集素( Phaseolus vulgaris agglutinin

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 胎盤間充質干細胞的分離剪取胎盤絨毛膜面1 ～ 2cm 厚的組織，剪成1mm × 1mm × 1mm 的碎塊，用PBS 漂洗至無色，用240U·mL － 1 DispaseⅡ和270U·mL － 1 Collagenase IV 37℃ 水浴消化1h，振蕩后靜置1min，使液體自然分為三層，吸取中間層懸液于離心管中，加入PBS，搖勻后700r·min － 1離心5min，棄上清，加入3mL 間充質干細胞培養液重懸沉淀，700r·min － 1 離心5min，棄上清。加入適量培養液混勻，轉入細胞培養瓶中，37℃，5%CO2培養箱中培養。

1. 2. 2 胎盤間充質細胞的繼代培養細胞生長至80%時，進行胰酶消化傳代。傳代時，以0. 25% 胰蛋白酶消化3 ～ 4min，加細胞培養液終止消化，700r·min － 1離心10min，棄消化液，加入細胞培養液吹打混勻，收集細胞懸液，接種于細胞培養瓶，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1. 2. 3 胎盤間充質細胞干細胞特異性抗原的鑒定選取處于指數生長期的第三代及凍存復蘇后正常生長中的胎盤間充質細胞，用0. 25% 胰蛋白酶消化后，收集細胞懸液于離心管中，調整細胞濃度為1 × 105·μL － 1 ; 取6 只試管，每管分別加15μL鼠抗人單克隆抗體CD29 － PE、CD34 － PE、CD44 －FITC、CD105 － FITC，以鼠抗人IgG2a － FITC、IgG1 － PE 作為陰性對照，再分別加入150μL 細胞懸液混勻，室溫避光放置10min，之后再用PBS 洗2次，流式細胞儀檢測，Cellquest 軟件獲取與分析。

1. 2. 4 胎盤間充質細胞染色體核型分析用秋水仙素( 終濃度為0. 05μg·mL － 1 ) 分別處理第二代和第十四代的胎盤間充質細胞2h 后收集細胞，用0. 075mol·L － 1 的KCl 溶液5mL 低滲處理細胞30min，固定、制片。將制片標本置65℃烘烤3h，室溫存放3 ～ 7d。37℃ 0. 25% 胰蛋白酶溶液中預處理10 ～ 20s，然后用GKN 液和自來水依次漂洗數秒，立即用Giemsa 染液染色10 ～ 15min，封片，顯微鏡下觀察并作染色體核型分析。