轉化后細菌菌落的快速裂解及質粒大小的檢查

一般情況下，可以根據質粒的大小來確定它是否帶有插入片段。以下方法足以產生在瓊脂糖凝膠的單個泳道上加樣所需的DNA量。操作方法如下：

1. 使轉化得到的細菌在含有氨卞青霉素的瓊脂培養基(LB)上生長至菌落直徑達1mm左右。

2. 用滅菌的牙簽挑取單菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB瓊脂平板上劃線。至少挑選20個左右的菌落照此劃線，平板于37℃培養過夜，然后保存于4℃，直到相應菌落的回收。

3. 在劃線培養的同時，將每一菌落的剩余部分用牙簽一一轉移并洗脫到事先加有50μL 滅菌的10mmo1/L EDTA(pH8.0)的1.5mL離心管中。

4. 每管加 50 μL配制的0.2mo1/L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振蕩30秒。

5. 于70℃溫育5分鐘，然后冷卻到室溫。

6. 加 3 μL 2mol/L KCl、0.2％溴酚藍的溶液，振蕩30秒。

7. 冰浴5分鐘。

8. 用微量離心機于4℃以12000g離心3分鐘，使細菌碎片的沉淀。

9. 制備1％的瓊脂糖凝膠(5mm厚)，將50μL上清液加入樣品槽內(5×2.5mm，長×寬)。

10. 染料遷移到凝膠全長的2/3—3/4時，于室溫將凝膠放入溴化乙錠溶液(0.5ug/mL水溶液)中，浸泡20—30分鐘。

11. 紫外燈下觀察、拍照。

通過與同時點樣的載體質粒的比較，不難發現重組子：比載體質粒遷移慢的很可能是含有插入片段的重組DNA。可從保存于4℃的重新劃線的平板上挑出相應的菌落，接種于2mL含抗菌素的LB培養液中培養過夜，然后提取質粒，用做重組時相同的限制酶做酶切鑒定。重組子應該可以切下預期大小的插入片段。