逆轉錄PCR的實驗步驟

 一、實驗器具與材料：

     1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸頭：1ml、200μl、20μl

3、勻漿管：5ml

4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個

5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）；1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）

7、量筒：50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

9、試管架：5ml、1.5ml、20μl

10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水

11、鋁制飯盒：4個

12、塑料小飯盒：1個

13、大瓷缸：2個

14、錫泊紙：一卷

15、卷紙：2卷

16、三角燒瓶：帶蓋，稍大

     二、實驗器具的處理與準備

     1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次（EP管）

2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干）

3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）

     三、試劑配制：

1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。

2、75%乙醇：用無水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高壓）

3、異丙醇：放入棕色瓶中

4、氯仿：放入棕色瓶中

5、瓊脂糖

     四、幾種緩沖液的配制：

     1、電泳緩沖液：

Tris 54g
     硼酸 27.5g
     0.5M EDTA 20ml  pH8.0
     蒸溜水 1000ml
     5×TBE （貯存液）
     再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液 450ml水--→500ml工作緩沖液

     2、上樣緩沖液：

0.25%溴酚藍
     0.25%二甲苯青FF
     30%甘油
     6×緩沖液，4℃保存

     五、瓊脂糖凝膠的配制：

1、1.0%：  1.0g瓊脂糖 100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現進行電泳。

2、1.5%：   同上，將瓊脂糖的量改為1.5g

     六、需購置的Rt-PCR材料：

Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
     dNTP: 1支
     oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
     M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
     RNasin: 1支 110
     -- -20℃
     DEPC 5g 110.00
     Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
      -- 4℃
     Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00

     七、引物合成

     1. 正義：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
     反義：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′

2、par-4:
     正義：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
     反義：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′

3、退火溫度計算：
     2（A T） 4（G C）
     正反義平均數，再上下波動度（±4℃，或±5℃）

4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分裝好

5、引物稀釋：
     加DEPC水量為（μl）= ? nmol / OD × 管上所標OD數×100
     是為10p mol / μl 濃度的引物溶液

     八、PCR產物電泳

先將1-10μl左右PCR產物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復吸打混勻后進行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結果掃描打印。

     九、幾個注意點：

1、逆轉錄的關鍵步驟是立即冰水浴。

2、Rt時，先打開PCR預熱30分鐘。

3、RNA抽提前，打開離心機預冷。