實驗器具的準備：RT-PCR所用的500μl和200μl薄壁EP管、移液器吸嘴最好用進口的，因為進口EP管、移液器吸嘴已經去除了RNasin，也已經滅菌處理過，可以直接用。實驗前用干凈的鑷子夾取出EP管、移液器吸嘴插好備用，注意鑷子不要碰到EP管內壁和吸嘴的尖部。如果用國產500μl和200μlEP管和移液器吸嘴，則要提前配制0.05%——0.1%的DEPC水，將EP管、移液器吸嘴和吸嘴盒都浸泡在DEPC水中過夜后再用蒸餾水反復沖洗掉粘附的DEPC，再高壓滅菌后60℃烤干備用。注意DEPC有毒，在配制及使用時應在通風櫥進行，應全程帶手套、口罩。
試劑的準備：做RT-PCR的試劑應提前確定儲備量，如試劑量不能滿足一次完整的RT-PCR操作，應馬上訂購試劑，等試劑到了以后再做。因為RNA易降解，提取之后就應立即反轉錄，或在-80℃冰箱中保存，但是反復凍溶也容易使RNA降解，所以一旦RNA提取或溶解就應立即進行反轉錄。RT-PCR的試劑都應在冰上溶解。
儀器：高速冷凍離心機、PCR儀、核酸檢測儀、凝膠成相系統都應提前檢查是否處于正常狀態。特別是PCR儀對環境溫度有要求時，應提前保證環境溫度。
RNA濃度測定：RNA提取后必須測濃度，記錄A260吸光度及A260/A280的值，計算RNA濃度及純度。
反應體系的計算：做反轉錄時，根據RNA濃度計算出RNA樣品的量和DEPC水的量。做PCR時，反應體系根據cDNA的樣品數計算每種試劑的量，可以多計算一個（吸嘴和管壁上會粘），混后均分。反應體系的計算是非常重要的，如果出錯，不但浪費試劑和樣品，結果有錯誤，也耽誤時間。