選擇重組蛋白表達的合適方法（一）

一、引言

選 擇 合 適 醜 組 蛋 白 表 達 方 法 對 于 能 否 及 時 獲 取 所 需 數 量 和 質 量 的 重z組蛋白非常關鍵。選 擇 了 錯 誤 的表達宿主可 能 導 致 蛋 白 質錯 誤 折 疊 或 低 量 表 達 . 缺 少 必要的翻譯后 修 飾或不適當的修飾 。選 擇 表 達 系 統時 需 騎 慮 的 因 素包括蛋 白 質 的 大 小 、二 硫 鍵的 數 目 、所 需 翻 譯 后 修飾的 類型 及 目 標 蛋 自 質 的 定 位 。純 化 后 的 重 組 蛋 自 的 期 應 用 在決 策 過 程 中 也 是 很 關 鍵 的 ，其 應 用 領 域 有 四 大 類 : 結 構 研 究 、體 外 活 性 分 析 、作 為 抗 原 制 備抗 體 和 體 內 研 究 。本 章 的 目 的 是 為 研 究 者 選 擇 合 適 的 表 達 系 統 提 供 指 導 。然 而 ，即 便 憑借這 些 指導 原 則， 很 多 倩 況 下 仍 然 無 法 預 先 確 定 哪 種 表 達 系 統 是 最 合 適 的 ，要 想 找 到 最 理想 的 表 達 系 統 ，必 須 對 多 種 表 達 系 統 進 行 嘗 試 。

目前，學術界和工業界正在使用大量的表達系統。其中的一些表達系統非常新，并未經過足夠的嘗試以評價其實用性。而且，一些已經建立的重組蛋白表達系統 (如轉基因動物），在技術上極具挑戰性，需要消耗大量時間，并且極為昂貴, 因此對于一般實驗室而言并不是可行的選擇。就本章而言，我們只討論大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病毒/昆蟲細胞及哺乳動物的表達系統(對這些表達系統更詳細的介紹見第12?1 5 章 ）。這 4 類表達系統都有簡單易懂的操作方案，小量制備成本低廉，可以很容易從同行或科研產品公司（如Invitrogen、EMI>Novagen、 Stratagene和 P rom ega等）獲得。下面將會對這幾類表達系統的特點和可以進行的選擇進行簡要介紹, 在此重點關注它們之間的不同之處。最后我們會介紹一些策略以幫助研究者選擇最合適的表達系統。

二、大腸桿菌

大 腸 桿 菌 是最早用于重組蛋白表達的宿主菌，其在蛋白質表達領域仍被認為是主要的工具。大腸桿菌較短的增殖時間使其成為一種簡單快捷的重組蛋白表達系統。因此, 評估重組基因在大腸桿菌中的表達只需要不到1 周的時間。培養大腸桿菌的培養基價格低廉，而且已有簡單直接的方法用于生產過程的放大(詳 見 第 12章）。

在 大 腸 桿 菌 中 ，重 組 蛋 白 通 常 定 位 于 胞 質（cytoplasm) 中 ，也 可 以 定 位 于 周 質(periplasm) ，在少數情況下會分泌到胞外。定位于胞質的蛋白質的表達效率是最高的，其產量通常可以占總生物質(biomass) 的 3〇% (Jana and D e b , 2〇〇5)。然而，重組蛋白過高的表達可能會導致不溶性蛋白聚集體的累積，從而形成包涵體Gndusi〇nS b〇dy)。不只是真核生物來源的蛋白質會形成包涵體，少數情況下，包括大腸桿菌在內的過表達原核生物來源的蛋白質也會形成包涵體。在大腸桿菌中，蛋白質翻譯和折疊的速率比在真核細胞中幾乎高1〇倍，這可能是真核蛋白質形成包涵體的原因（Andersson et al.，1982;Goustin and W ilt，1982)。在某些情況下，包涵體大大妨礙了獲得可溶的活性蛋白質。

不過，有時包涵體也能帶來好處，其不易被蛋白酶降解，易于離心濃縮，很少被其他蛋白質污染，而且通過努力，也能將其再折疊成有活性的可溶性蛋白質(詳 見 第 1 7 章）。

1.大腸桿菌： 溫度和分子伴侶

已經有一些技術用于在胞質中盡可能多地形成可溶的正確折疊的蛋白質，而盡可能少地形成包涵體。最容易的方法是在蛋白質表達時降低溫度至15?30°C (Sahdevetal. ，2008)。據推測，降低溫度會降低蛋白質轉錄、翻譯和折疊的速率，從而使蛋白質能夠正確折疊（V e r a e ta L , 2006)。此 外 ，研 究 顯 示 ，低 溫 還 會 降 低 熱 休 克 蛋 白 酶（heatshock protease)的活性 (Spiess e ta L , 1999)。一些研究者通過在胞質中與重組蛋白共表達分子伴侶(molecular chaperone)來促進蛋白質的可溶性 (Young etal. , 2004)。該方法的運用似乎具有蛋白質特異性，因此需要針對每種目標重組蛋白分別進行實驗(Baneyx and Mujacic，2004)。

2. 大腸桿菌： 融合標簽

在重組蛋白的 N 端 或 C 端融合可溶性的融合標簽(fusion tag)是提高許多重組蛋白可溶性的另一種方法(Esposito and Chatterjee, 2006)。已經證明能夠提高重組蛋白可溶性的融合標簽包括谷胱甘肽S轉移酶如glutathione-S-transferase,GST)、硫氧還蛋白（thioredoxin)、麥 芽 糖 結 合 蛋 白（maltose-binding protein，M B P )、小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-modifier,S U M O )及 N u s A 標簽（JV-utilization substrate)。其中 G S T 標簽 和 M B P 標簽還有另外的好處, 可以用做親和純化的標簽。然而令人遺憾的是沒有哪一種標簽能夠適用于所有的重組蛋白，必須對多種融合標簽的促可溶表達能力進行評估。有多種策略可用于移除重組蛋白的融合標簽，廣泛的做法是在融合標簽和重組蛋白之間插入蛋白酶酶切位點，然后使用特異性的蛋白酶將其切除。有時候，移除標簽后重組蛋白可能會變得不可溶，所以必須對這一方法進行謹慎的測試。

3.大腸桿菌： 二硫鍵的形成

對于胞質表達，大腸桿菌通常不能促使重組蛋白二硫鍵(disulfide bond)的正確形成；由于二硫鍵氧化還原酶系統(Dsb system)催化作用的存在, 周質通常是大腸桿菌中唯一可形成二硫鍵的場所(Andersen e t a l.， 1997; Bardwell, 1994) 。 因此，如果重組蛋白需要形成二硫鍵，就需要利用一個可切割的信號肽（如 pelB)將其定位于周質。然而 ，周質表達的一個主要不利之處在于蛋白質的表達量會大大降低。硫氧還蛋白（thioredoxin) 和谷氧還蛋白（glutaredoxin) 能夠促進胞質內半腕氣酸的還原反應，通過對大腸桿菌基因組的改造以破壞D sb系統的硫氧還蛋白還原酶基因（thioredoxin reductase gene「 trrB )和谷胱甘肽還原酶基（glutathione reductase gene,g o r), 就可以在胞質內創造更加適于二硫鍵形成的環境(Bessette e ta l.，1999)。這些基因工程改造的菌株已由EMI>Novagen(Origami)公司實現了商業化。如果需要形成更多的二硫鍵，可以將重組蛋白與硫氧還蛋白融合后在trxB-/gor””大腸桿菌菌株中進行表(LaVallie et aL ， 1993) 。

4. 大 腸 桿 菌 ： 翻譯后修飾

最 后 ，必 須 認 識 到 相 比 于 真 核 生 物 ，大 腸 桿 菌 對 蛋 白 質 進 行 翻 譯 后 修 飾 (posttranslational modification) 的 能 力 有 限 。例 如 ，大 腸 桿 菌 不 支 持 酶 介 導 的 N -連 接 的 糖 基 化 (iVlinked glycosylation)、0 連 接 的 糖 基 化（O l i n k e d glycosylation) 、酰 胺 化（amidation) 、輕基 化 (hydroxylation) 、豆 蘧 醜 化（myristoylation) 、棕 櫚 酰 化 (palmitoylation) 和 硫 酸 化(sulfation)