通過平板裂解和洗脫制備λ噬菌體原種實驗

λ 噬菌體原種 大腸桿菌鋪平板細菌

氯仿 SM

LB 或 NZCYM 瓊脂平板 Sorvall SS-34 或相當型號 水浴 螺口或卡口聚丙稀試管

一、材料

1. 緩沖液和溶液

氯仿，SM。

2. 培養基

LB 或 NZCYM 瓊脂平板



LB 或 NZCYM 頂層瓊脂糖（0.7%)

3. 離心機和轉子

Sorvall SS-34 或相當型號

4. 專用設備

加熱設備或預置 47℃ 的水浴

螺口或卡口聚丙稀試管（13 mm X 100 mm 或更大)

5. 載體和菌株

λ 噬菌體原種

大腸桿菌鋪平板細菌

二、方法

1. 鋪平板感染培養物的制備：

對直徑為 10 cm 的培養皿，取 10⁵ pfu 的噬菌體（通常約為一個噬菌斑重懸液的 1/10 或一個大噬菌斑重懸液的 1/100）與 0.1 ml 鋪平板細菌混勻。

對直徑為 15 cm 的培養皿，取 2X10⁵ pfu 的噬菌體與 0.2 ml 鋪平板細菌混勻。

至少要設置一個含未感染細胞的對照管，將感染培養物和對照均置 37℃ 培養 20 min，使病毒吸附到細胞上。

如果制備不易生長的 λ 噬菌體原種，則每 0.1 ml 的鋪平板細菌就要接種 10⁶ pfu 的噬菌體。

2. 加 3 ml 已熔化的 47℃ 的瓊脂糖（10 cm 平板）或 7 ml ( 15 cm 平板）至感染細胞的第一個試管中，通過輕拍或渦旋振蕩數秒混勻，立即倒入已標明的瓊脂平板中央。盡量避免氣泡的產生。旋轉平板確保細菌和頂層瓊脂糖分布均勻。重復這一步，直到每管中的東西均轉移至各個平板中。

3. 將平板于 37℃ 正置約 12~16 h。

在培養過程平板沒有倒置，是為了鼓勵在平皿表面形成水珠，這使得噬菌體更容易擴散。

在收集時，噬菌斑應相互接觸，細菌生長的惟一可見跡象是標志著相鄰噬菌斑結合部位的輕薄透明的邊緣帶。含未感染細胞的平板應形成一片光滑的菌苔。

4. 從培養箱中取出平板，加入 SM ( 10 ml 平板加 5 ml，15 ml 平板加 10 ml )，在 4℃ 搖床上晃動數小時。

5. 用不同的巴斯德吸管分別將各個平板中的 SM 盡可能地轉移至螺口或卡口的無菌聚丙烯試管中。

6. 在每個平板中再加 1 ml 新鮮的 SM，輕輕晃動液體，隨后將平板傾斜放置 15 min，使所有的液體集中于一個地方，再吸取 SM 并與第一次收集的混合，舍棄平板。

7. 加 0.1 ml 氯仿至含 SM 的各試管中，輕輕地渦旋振蕩，然后通過于 4℃ 4000 g ( Sorvall SS-34 為 5800 r/min ) 離心 10 min 去掉細胞碎片。

8. 將上清轉移至新的聚丙烯試管中，在每管中加一滴氯仿。將獲得的噬菌體平板培養原種于 4℃ 保存。

9. 如 “λ 噬菌體的鋪平板培養” 所述，用噬菌斑分析的方法測定每個原種中感染性病毒顆粒的濃度。