通過雜交篩選未擴增的黏粒文庫（濾膜影印）

一、材料

1. 培養基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 瓊脂平板（150 mm )

TB 培養基

2. 專用設備

厚玻璃板

皮下注射針頭（17號）

滅菌的硝酸纖維素膜或尼龍膜（137 mm)

滅菌的 Whatman 1 號濾紙

3. 載體與菌株

λ 噬菌體包裝反應

適合平板接種的大腸桿菌菌株（例如：XL1-BLUE, ED8767, NM554, DH5αMCR)。

二、方法

已包裝到 λ 噬菌體顆粒中的黏粒 DNA 轉化至大腸桿菌

1. 計算能產生 3 萬~ 5 萬個轉化菌落的包裝反應體積。

2. 準備數支滅菌的試管，試管中加有上述體積的包裝反應產物和 0.2 ml 的接種細菌。

3. 37℃ 溫育試管 20 min。

4. 在每支試管中加入 0.5 ml  TB, 繼續溫育 45 min。

5. 將無菌濾膜平鋪于 150 mm 的含有 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 瓊脂平板表面（所需平板數與步驟 2 的試管數相等)。

6. 用一滅菌涂布棒將每支試管中的混合物均勻涂布在瓊脂平板的濾膜上。當接種物被濾膜吸收后，將平板置于 37℃ 培養箱數小時或過夜（12~15 h)。

7. 將一張 137 mm 標有編號的無菌濾膜平鋪于含 25 μg/ml 的新鮮 TB 瓊脂平板上。

8. 將一張無菌的 Whatman 1 號濾紙平鋪于厚的無菌的玻璃板上。

9. 用無菌平頭鑷子將影印濾膜從新鮮的 TB 瓊脂平板（步驟7 ) 轉移到 Whatman 1 號濾紙上。

10. 再用鑷子將帶有轉化菌落的主濾膜從 TB 瓊脂平板（步驟 6)上取下，菌落面朝下準確放到位于 Whatman 1 號濾紙上的帶有編號的影印濾膜上。用另一張無菌 Whatman 1 號濾紙覆蓋在兩張濾膜之上。

11. 用第二塊無菌厚玻璃平板將兩張濾膜緊密的壓在一起。

12. 移去上面的厚玻璃平板與 Whatman 1 號濾紙，用 17 號皮下針頭沿每對硝酸纖維素膜或尼龍膜濾膜邊緣不對稱地打一系列小孔( 5 個左右已足夠 ) 使兩張濾膜相對定位。

影印濾膜的生長

13. 剝離兩張濾膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜濾膜)，迅速將它們重新平鋪于各自的 TB 瓊脂平板上（含 25 μg/ml 卡那霉素）。

14. 37℃ 溫育主濾膜與影印濾膜數小時，直至細菌菌落直徑至 0.5~1.0 mm。

15. 用 Parafilm 膜封好主平板，并倒置貯存于 4℃。

16. 裂解影印濾膜上的菌落，將濾膜與放射性標記探針雜交。

彩印濾膜可用于再次復制文庫，或貯存于 -70℃。