酵母細胞核制備

實驗材料 酵母菌

試劑、試劑盒 細胞核緩沖液Ficoll緩沖液

儀器、耗材 勻漿機

實驗步驟

1.  將酵母菌接種于YPD培養基（100 ml 到20 L），劇烈搖動或強制通氣條件下培養至對數中期（OD600≈1~5）。培養物在預稱重的離心瓶中于4℃， 1 500 g 離心5 min。
 
2.  確定酵母細胞的濕重，它與壓緊的細胞體積大致相同。在所有的后續步驟中菌體的量將當作1體積來考慮。
 
3.  細胞用2~4體積冰水重懸，并立即于4℃，1 500 g 離心5 min，加入1體積含30 mmol/l DTT的酵母消解酶緩沖液重懸細胞、室溫放置15 min。

4.  于4℃，1 500 g 離心5 min，菌體用3體積的酵母消解酶緩沖液重懸。
 
5.  在每毫升原壓緊細胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平搖床以大約50 r/min 的轉速溫育40 min，通過水滲破法確定菌體是否完全轉變為原生質體，如果原生質體化不完全，應繼續溫育直到完全。
 
6.  1 500 g 離心原生質體5 min，小心棄上清，原生質體球沉淀塊不如細胞沉淀塊般緊密。
 
7.  用2體積冰冷的酵母消解酶緩沖液輕輕重懸沉淀，原生質體1 500 g 離心5 min，重復2次。

8.  用0.5體積的細胞核緩沖液重懸細胞。

9.  將細胞懸液逐滴加入盛有15~25體積冰冷的Ficoll緩沖液的燒杯中，此過程在冰浴或冷室中進行，不斷地振蕩。
 
10.  將懸浮液轉移到離心管中，于4℃，3 000 g 離心5 min，如果要完全除去細胞碎片， 重復離心幾次。
 
11.  將上清轉移至一個新的離心管中，于4℃12 000 g 離心20 min，沉淀用5~10倍體積的細胞核緩沖液重懸；再于4℃，12 000 g 離心。
 
12.  為了獲得細胞胞核裂解液，用1體積裂解緩沖液重懸細胞核沉淀。

13.  用2體枳酵母消解酶緩沖液輕輕重懸沉淀，不要試圖得到均一的懸液，只需將沉淀物從管壁上洗下來，懸轉10~20次，于1 500 g 離心10 min 回收原生質體。

14.  用玻璃棒仔細將原生質體沉淀重懸于1體積裂解緩沖液中。
 
15.  在Dounce 勻漿器中用最緊密的研杵，沖擊15~20次以裂解原生質體。

16.  往超離心管中加入一半管體積原生質體裂解液，再加等體積的抽提緩沖液，將離心管封口。于4℃在旋轉輪或搖床上輕輕倒轉離心管15~30 min。

17.  于4℃，45Ti轉子上100 000 g 離心90 min。收集上清，在100體積貯存緩沖液中透析2 ~ 4 h。將透析袋轉移到100體積新鮮的貯存緩沖液中，再透析2~4 h。
 
18.  取出幾微升透析液，用水作1 ：1 000稀釋，測定電導率。如果和類似稀釋度的貯存緩沖液相等或低于一定值時（通常100~250 mmol/l NaCl），繼續步驟19，否則繼續透析。
 
19.  于4℃，10 000 g 離心10 min。收集透析液上清。分成小份放在液氮中冷凍，于 -80℃貯存。