重疊延伸法進行特異位點誘變需要四種引物（請見圖 13-4)(Higuchi et al.1988, Hetal.1989)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 試劑、試劑盒 | 擴增緩沖液熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠寡核苷酸引物模板 DNA |
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| 儀器、耗材 | 帶屏障裝置的自動移液器吸頭微型離心管酶可調式移液器可按所需擴增條件設定程序的熱循環儀 |
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| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液的成分及所需試劑請見附錄 1。
將貯存液稀釋釋到適當的濃度。
10x 擴增緩沖液
含有四種 dNTP 的混合溶液，每種 dNTP 濃度為 20 mmol/L。
酶和緩沖液
熱穩定 DNA 聚合酶
為了避免堿基的錯誤摻入，在重疊延伸誘變反應中應使用帶 3'—5'外切核酸酶校對能力的髙效熱穩定 DNA 聚合酶。另外. 使用的 DNA 聚合酶一定不能具有催化非模板性摻入腺苷酸殘基的能力。具備此種特性的 DNA 聚合酶包括 Puo DNA 聚合酶 (Boehringer Mannheim),rTth DNA 聚合酶 XL(Pwkin Elmer)。VentR DNA 聚合酶（New England Biolabs) 和 Pfu DNA 聚合酶 (Stmagene)。
為長片段 PCR 反應所設計的熱穩定 DNA 聚合酶混合物也適用于重疊延伸誘變反應。
凝膠
含 0.5ug/ml 溴化乙錠的瓊脂糖凝膠（1%) 或聚丙烯酰胺凝膠
請見步驟 6 和 11。
核酸和核苷酸
寡核苷酸引物
每種引物的長度應為 20~30 個核苷酸. 含有大致相同數量的四種堿基，G 和 C 殘基的分布應均勻，較低的形成穩定二級結構傾向。誘變引物 FM 和 RM 之間至少有 15 個堿基的重疊序列（請見圖 13-4), 錯配堿基應位于引物序列的中部。在擴增 DNA 片段的 3'和 5'端引物（即具有野生型序列 R2 和 F2 引物）可以設置單一的限制性酶切位點，以便于后續步驟中誘變 DNA 片段的克隆。引物設計的一般原則，請見第 10 章中導言部分關于核苷酸引物的設計。
在 DNA 自動合成儀上合成的寡核苷酸引物一般不需要純化，可直接用在重疊誘變中。
模板 DNA
誘變中使用的模板通常是含感興趣的基因或 cDNA 的質粒 DNA。將 DNA 以 1ug/ml 的濃度溶解在含低濃度 EDTA(<0.1 mmol/L) 的 10mmol/L Tris-Cl(pH7.6) 的溶液中。
專用設備
帶屏障裝置的自動移液器吸頭
微型離心管（0.5 ml 擴增用薄壁管）
可調式移液器
可按所需擴增條件設定程序的熱循環儀
如果熱循環儀不配備加熱蓋裝置，使用礦物油或石蠟油以防止 PCR 過程中反應混合物液體的揮發。
其他試劑
本方案步驟 11 需要的試劑列在第 1 章方案 17 或 19 中。
本方案步驟 12 需要的試劑列在第 12 章方案 3,4 或 5 中。
方法
1. 依據材料和方法中的要求和已知 DNA 序列設計合成寡核苷酸引物 FM,RM,R2 和 F2。
2. 在一個 0.5 ml 的微量離心管或擴增管中混合以下試劑，組成 PCR 反應 1。
模板 DNA 約 100ng
10x 擴增緩沖液 10ul
20 mmol/L4 種 dNTP 混合溶液 1.0ul
5umol/L 引物 FM(30pmoles) 6.0ul
5umol/L 引物 R2(30pmoles) 6.0ul
熱穩定 DMA 聚合酶 1~2 單位
加水至 100ul
3. 在第二個微量離心管或擴增管中混合以下試劑，組成 PCR 反應 2。
模板 DNA 約 100ng
10x 擴增緩沖液 10ul
20 mmol/L4 種 dNTP 混合溶液 1.0ul
5umol/L 引物 RM(30pmoles) 6.0ul
5umol/L 引物 F2(30pmoles) 6.0ul
熱穩定 DNA 聚合酶 1~2 單位
加水至 100ul
4. 如果熱循環儀沒有加熱蓋，用一滴石蠟油（約 50ul) 覆蓋 PCR 反應液。將反應管置于熱循環儀中。
5. 用下表中給出的變性、退火、聚合所需的時間和溫度擴增 DNA 片段。
上述反應條件適合于 0.5 ml 薄壁管和 100ul 反應體積，以及 Perkin-Elmer 9600、9700,Master Cycler(Eppendorf) 或 PTC 100(MJ Research) 熱循環儀。使用其他類型的儀器或不同的反應體積時需調整上述反應條件。
聚合反應所需的時間應通過計算熱穩定 DNA 聚合酶的聚合效率及 DNA 模板長度來獲得。
應根據誘變引物序列調節退火反應的溫度。
6. 各取以上兩組 PCR 反應產物的 5% 進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳估計擴增靶 DNA 的濃度。
7. 用第 5 章中描述的方法之一純化以上兩組 PCR 產物。對產物進行純化往往增加步驟 8 中所希望的擴增產物的產量。并可降低錯誤擴增產物的背景。（選做）
8. 在一個滅菌的 0.5 ml 的微量離心管或擴增管中混合以下試劑進行擴增反應，連接靶基因的 5'和 3'端。
PCR1 擴增產物（步驟 2) 約 50ng
PCR2 擴增產物（步驟 3) 約 50ng
10x 擴增緩沖液 10ul
5umol/L 引物 F2(知 pmoles) 6.0ul
5umol/L 引物 R2(30pmoles) 6.0ul
熱穩定 DNA 聚合酶 1~2 單位
加水至 100ul
9. 如果熱循環儀沒有加熱蓋，用一滴輕石蠟油（約 50ul) 覆蓋 PCR 反應液。將反應管置于熱循環儀中。
10. 用步驟 5 給出的變性、退火、聚合反應所需的時間和溫度進行擴增。
11. 取 PCR 反應產物的 5% 進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳估計擴增的靶 DNA 濃度。
如果引物 F2 和 R2 序列中加進了限制酶切位點，用這些限制酶消化擴增的 DNA, 然后把它們亞克隆至適當的栽體。也可以將步驟 10 擴增的 DNA 片段磷酸化，然后連接到用限制酶切割成鈍端的載體中。
12. 克隆后確證擴增 DNA 片段的全序列，保證在操作過程中沒有產生除引物 FM 和 RM 攜帶突變之外的其他突變。
所有 DNA 聚合酶在體外反應中都顯示出可測量的錯誤摻入率。 |
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