重組表達載體pET32aHisAPC10的序列測定

通過上述實驗所構建的表達質粒pET-32a-His-APC10經限制性內切酶分析正確后，必須進行DNA序列測定，以獲得序列完全正確的克隆。

1. 基本原理
目前應用的DNA序列測定方法有雙脫氧法（Sanger法）和化學測序法（Maxam-Gilbert法），在變性聚丙稀酰胺凝膠（測序膠）上進行高分離度的電泳過程是傳統DNA序列測定的工作基礎。本實驗采用新的毛細管電泳法，根據雙脫氧法測序的原理，進行熱循環測序。測序反應中，測序酶FS以待測DNA為模板，在引物的啟動下，按5'到3'方向合成與模板互補的新生DNA鏈；同時，將某一特定的熒光標記的雙脫氧核糖核酸( ddNTP )隨機摻入在新生鏈中，使合成反應被選擇性終止在A、C、G、T處，形成長短不一的末端有熒光標記的DNA鏈。由于四種雙脫氧核糖核酸末端標記有不同的熒光顏料，在激光激發下，不同熒光標記的ddNTP具有不同的熒光波長，因此，每個樣品只需作一個反應。用熱循環法進行DNA測序反應，少量的模板被重復用于生產DNA序列梯度，雙脫氧測序反應混合物反復進行類似PCR反應的變性、退火和延伸的步驟，測序產物以線性增長。反應產物經純化、變性后，上樣到預裝有POP-6多聚體的毛細管中。樣品注射液中含有甲酰胺，能破壞DNA的二級結構，在電場作用下，單鏈DNA因分子量大小不同而出現泳動速度的差異，分辨率可達一個堿基。當長短不同的DNA鏈依次通過熒光界面時，該界面的激光光束可激發其末端的熒光物質，使其發射熒光。熒光信號被CCD照相機接收并轉換為電信號，測序軟件對其進行分析、轉換并儲存為序列圖譜。

2. 材料
1）待測DNA模板，即pET-32a-His-APC10。
2）Applied Biosystems生產的ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits，內含不同熒光顏料標記的ddNTP mix、dNTP mix、耐熱DNA聚合酶FS、MgCl2、pH9.0的Tris-HCl緩沖液等測序所需試劑。
3）乙醇，醋酸鈉，樣品注射液Hi-Di Formamide。

3. 儀器
1) Applied Biosystems生產的全自動毛細管測序儀ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer。
2) Applied Biosystems生產的全自動PCR儀GeneAmp PCR System 9700。

易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

4. 方法
1) 測序反應：
PCR總反應體積為10μl，組成如下：
DNA 250ng
Primer 3.2pmol/μl 1μl
BigDye mix 4μl
H2O x μl
PCR反應條件如下：
98°C 2min
96°C 20 sec, 50°C 20 sec, 60°C 4min, 25 cycles
反應產物純化：本實驗利用乙醇沉淀法純化延伸產物，方法如下：
沉淀反應物，將以下各組分混勻，-70°C，靜置10 min；
PCR反應液 10μl
水 10μl
3M NaAc 2μl
乙醇(100%) 50μl
離心，13，000rpm，20min，4°C，棄上清；
洗滌，加200μl 90%乙醇，離心，13，000rpm，20min，4°C，棄上清；
重復上述過程一次；
干燥 ，加30μl Hi-Di Formamide，重懸延伸產物；
95°C，變性5分鐘
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
2) 毛細管電泳：
將溶解后的反應產物轉至96孔板中，自動上樣器上樣，電泳。
3) 數據采集與處理：
CCD照相機接收熒光信號并將其轉換為電信號，測序軟件分析、處理并儲存數據。

5. 特點
1) 模板范圍寬，不必將目的基因克隆到特定載體中，可對單鏈、雙鏈DNA模板、PCR產物及BAC等進行測序。
2) 單鏈和雙鏈模板的操作程序相同。
3) 雙鏈模板不需預先進行堿變性。
4) 需要的模板量很少。
5) 測序反應需要的人工操作較少，不需要制聚丙稀酰胺凝膠，不需要人工上樣，自動化程度高。
6) 16個樣品同時檢測，測序的敏感性高。
7) 可快速分離樣品，電泳僅需要兩小時。
8) 結果重復性好。

6. 技術要點
1) 模板制備：模板純度要求較高，不能有蛋白質、鹽、去垢劑及RNA的殘留。
2) 對于GC比例較高的模板（>70%），在反應前，先在98°C加熱5分鐘，使模板充分變性。
3) 如果引物的Tm值>60°C ，退火反應可省略；如果引物的Tm<50°C，退火反應時間應延長至30秒鐘或將退火溫度降低至48°C。
4) 模板量要適中，具體用量可參照以下標準：
PCR產物： 100-200bp 1-3 ng
200-500bp 3-10 ng
500-1000bp 5-20 ng
1000-2000bp 10-40 ng
>2000bp 40-100 ng
單鏈模板：50-100 ng
雙鏈模板：200-500 ng
如果待測PCR產物小于30 bp，反應可少于20個循環。
5）反應產物必需純化，徹底去除未摻入的熒光標記的雙脫氧核糖核酸，純化方法可采用柱純化法或沉淀法。
6）用其它型號的PCR儀時，應優化PCR反應條件。