反向間接血凝法
測定原理是致敏血球與被檢液的相應抗原發生凝聚反應即出現反向間接血凝現象。
(1)試劑
①反向間接血凝診斷試劑盒。
②1%致敏血球(各型):用砂輪打開凍干致敏血球的安瓿,加3mL 生理鹽水溶解,于37℃水浴1h 后使用。
③1%正常兔血清鹽水:用砂輪打開凍干正常兔血清的安瓿,加0.5mL 生理鹽水溶解吸入裝有生理鹽水(50mL)的容器中即成1%正常兔血清鹽水。
④0.85%生理鹽水。
⑤聚乙二醇(MW200000)。
(2)設備與材料
①均質器及均質杯(250mL)。
②離心機及離心瓶(250mL)。
③透析袋(MW12000～14000)。
④血凝反應板(96孔)。
⑤微量加樣器(25μL)。
⑥微量混合器。
⑦培養箱。
(3)操作步驟
①稱取蘑菇罐頭中的湯與固形物各50g,放入均質杯中,加入0.85%NaCl 100mL,高速均質3min。
②均質后的混合物置離心瓶中,以4500r/min 離心30min。
③吸上清液,裝入透析袋內,包埋于 PEG 中,4℃濃縮過夜。
④用3mL 生理鹽水分數次將透析袋內容物洗出。
⑤將樣品液移入5mL 離心管中,7000～8000r/min 離心20min。
⑥吸取上清液測定 PH 值,并根據具體情況用1mol/L NaOH 或1mol/L HCl 調 PH 值為7.0,待作反向間接血凝試驗。
(4)檢測
①根據樣品量的多少來確定在同一塊板上做幾種型別的腸毒素抗體致敏血球(以下簡稱致敏血球)。但每一型致敏血球都必須有一個陽性對照(標準腸毒素)和一個陰性對照(1%正常兔血清鹽水)。實驗前要預先在記錄紙上把每一孔要加入的樣品及致敏血球做好標記。
②在樣品中加入30%正常兔血清鹽水0.1mL,充分混勻,使樣品液中最終含有1%正常兔血清。(注意:若樣品液保存在4℃冰箱中,檢測前應置室溫平衡。)
③用微量加樣器在每孔中加入25μL 的樣品液。
④在陰性對照孔中加入25μL 正常兔血清鹽水。
⑤在陽性對照孔中加入25μL 適當稀釋濃度的標準腸毒素。該濃度可預先用不同濃度梯度的腸毒素做實驗而定,一般取陽性結果為四個加號的最高稀釋度為宜。
⑥觀察每一孔中加樣完畢后是否有氣泡存在,用滅菌的接種針將氣泡排除。
⑦于上述每一孔中迅速加入25μL1%的致敏血球(若血球是放冰箱保存的,使用前應置室溫平衡)。
⑧把血凝反應板放在微量混合器上充分振蕩混勻1min。
⑨取下血凝反應板,用璃璃板蓋住表面置37℃靜置2h 后觀察結果。
(5)結果判定
①++++:血球呈均勻凝集,布滿整個孔。
②+++:血球大部分凝集,較①稍小。
③++:血球50%凝集,邊緣較松散,孔底有少量顆粒沉積。
④+:血球在孔底沉淀面積較大,周圍有散在的少量凝集。
⑤±:血球下沉至孔底,周圍有較小凝集。
⑥-:血球下沉至孔底呈點狀,邊緣控齊。
一般“++”以上做為陽性結果。