根據鏈球菌所致疾病不同，可采取膿汁、咽拭、血液等標本送檢。
（一）直接涂片鏡檢
取膿汁涂片，革蘭氏染色，鏡檢，發現革蘭氏陽性呈鏈狀排列的球菌，就可以初步診斷。
（二）分離培養
膿汁或棉拭直接劃線接種在血瓊脂平板上，孵育后觀察有無鏈球菌菌落。根據溶血性不同，可區分為甲型、乙型或丙型鏈球菌。有β溶血的菌落，應與葡萄球菌區別；α溶血的菌落，要和肺炎球菌鑒別。疑有敗血癥的血標本，應先在葡萄糖肉湯中增菌后再在血平板上分離鑒定。心內膜炎病例，培養草綠色鏈球菌宜孵育3個星期以上。
（三）血清學試驗
抗鏈球菌溶血素O試驗（Anti-streptolysinotest,ASOtest）簡稱抗O試驗。常用于風濕熱的輔助診斷。患者血清中的抗O大多在250單位左右，活動者一般超過400單位。
Dick試驗猩紅熱病人早期陽性，病后轉陰。