實驗方法原理
實驗材料 總 RNA
試劑、試劑盒 無 RNase 的 DTTSuperScript 緩沖液無 RNase 的標準 dNTPRNase 抑制劑第二鏈緩沖液 IIRNase HTE 緩沖液平衡的酚氯仿糖原乙醇通用緩沖液乙酸鈉ATPTE 緩沖液PCR 緩沖液MgCl2RediLoad甲酰胺緩沖液
儀器、耗材 22°C、37°C、42°C、65°C 和 75°C 水浴有熱蓋的熱循環儀96 孔 PCR 板
實驗步驟
實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」
1. 乙醇沉淀 50 ug 總 RNA，重溶于 15.5 ul 無 RNase 的水中。加入 1.5 ul 10 umol/L cDNA 引物 CP29V，65°C 變性 5 min（如在一個加熱塊上），冰上冷卻。
2. 在冰上混合第一鏈合成反應的成分（總體積 29.1 ul）：
17.0 ul 剛剛變性的 cDNA 和 cDNA 引物
3.0 ul 100 mmol/L 無 RNase 的 DTT
6.0 ul 5× SuperScript 緩沖液
1.5 ul 10 mmol/L 無 RNase 的 dNTP
0.6 ul 40 U/ul 的 RNase 抑制劑（如 RNasin）
1.0 ul 200 U/ul SuperScript II 逆轉錄酶
混勻，42°C 溫育 1h。置于冰上中止反應。
3.在冰上混合第二鏈合成反應的成分（總體積 207.2 ul）：
48 ul 5× 第二鏈緩沖液 II
3.6 ul 10 mmol/L dNTP
148.4 ul H2O
1.2 ul 1.5 U/ul RNase H
6.0 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 I
4. 把第一鏈的和第二鏈反應體系合在一起。混勻，22°C 溫育 2 h。完成第二鏈合成后， 75°C 加熱 20 min 滅活 DNA 聚合酶 I。
5. 用 100 ul pH 8.0 的 TE 緩沖液平衡的酚抽提。再用 100 ul 氯仿抽提。
6.為進行按分子大小選擇性的 PEG 沉淀，小心混合：
200 ul 酚/氯仿抽提的 ds cDNA
1.0 ul 20 mg/ml 糖原
200 ul 28％（m/V）PEG 8000/3.6 mmol/L MgCl2
反應體系（總體積 401 ul）室溫放置 5 min，然后 10°C，最高速離心 15 min。70％ 的乙醇小心洗滌沉淀。
這步沉淀可除去未摻入的 cDNA 引物和小分子核酸（如低于 100 nt）。因為 PEG 大小選擇性沉淀易受微小濃度變化的影響，所以必須遵循如下方針：
6.1 確保準確吸取 200 ul ds cDNA。溶解在水相中的氯仿的蒸氣壓力傾向于取代吸頭中液體的體積使得準確的吸取變的困難。克服這個問題的一個辦法是在吸取 200 ul 體積前，先用 50～100 ul 的體積反復吹吸（5～10 次）氯仿飽和的水相，使吸頭中的氯仿蒸氣達到飽和。
6.2 因為 28％ 的 PEG 8000/3.6 mmol/L MgCl2 相當黏稠，要小心地慢慢吸取，同樣需要確保準確轉移所需的體積。
6.3 首先小心地重復顛倒混勻，然后劇烈地渦旋混勻。因為溶液黏稠，徹底混勻需要一些時間。
7. 在冰上把沉淀溶解在下述溶液里（總共 96 ul）：
15.0 ul 10× 通用緩沖液
81.0 ul H2O
8. 加入 4 ul 4 U/ul 的 MboI，37°C 溫育 1 h。65°C 加熱 20 min 使酶滅活。
9. 用 50 ul pH 8.0 TE 平衡的酚抽提，再用 50 ul 氯仿抽提。加入 1 ul 糖原和 10 ul pH 5.2 的 3 mol/L 乙酸鈉，2.5 倍體積 100％ 的乙醇。最高速離心 20 min， 70％ 乙醇洗滌沉淀。輕微晾干（5～10 min）。不要加熱或真空干燥，因為過度的干燥會使得 DNA 沉淀很難溶解。
10. 把沉淀溶解在由以下成分組成的連接混合液里（總體積 20 ul）
1.2 ul 10× 連接緩沖液
2.0 ul 10 mmol/L ATP
8.0 ul 0.5 ug/ul MboI-連接子 ML2025
7.8 ul H2O
1.0 ul 1 U/ul 的 T4 DNA 連接酶
16°C 連接過夜或 4°C 連接一個周末。
11. 加入 90 ul 的水，混勻，用 50 ul TE 平衡的酚抽提，再用 50 ul 氯仿抽提。配制第二次 PEG 沉淀反應去除未連接的連接子（總體積 201 ul）：
100 ul 酚抽提過的連接產物
1.0 ul 糖原
100 ul 28％ 的 PEG 8000/3.6 mmol/L MgCl2
室溫放置 5 min，然后 10°C，最高速離心 15 min。70％ 的乙醇小心洗滌沉淀，重溶于 40 ul pH 8.0 TE 緩沖液。
12. 配制第一輪擴增反應。在冰上把 3 個 4 umol/L CP28X1（X1＝A、C 或 G）引物和 4 個 4 umol/L 引物 ML19Y1（Y1＝A、C、G 或 T）各 1 ul 兩兩混合在分開的管里（共 12 個反應）。用所有其他的成分配制一個通用混合液（一個反應的配方）：
2.0 ul 模板（PEG 沉淀的連接產物）
2.0 ul 10× PCR 緩沖液
1.5 ul 20 mmol/L MgCl2
0.4 ul 10 mmol/L dNTP
2.0 ul RediLoad
9.9 ul H2O
0.2 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
配制好反應后把管子放到熱循環儀上預熱到 90°C。
13. 運行下面的循環程序：
起始步驟：
1 min 94°C（變性）
25 輪循環：
20 s 94°C（變性）
30 s 65°C（引物復性）
4 min 72°C（引物延伸）
最后步驟：
不確定 10°C（保持/延伸）
14. 每個反應取 10 ul 上樣到 1.5％ 的瓊脂糖凝膠上，電泳檢查是否擴增成功。100 bp 的序列階梯作為分子質量對照。
引物量決定產物的量，可以以此調整 PCR 的條件。長時間的延伸確保不同大小的產物都能得到擴增而沒有不利于長片段的偏差。瓊脂糖電泳應該出現約 100～700 bp 的拖尾，少有明確的條帶（如果有的話）。最重要的是用相同引物擴增的不同 RNA 樣品的擴增產物應該看起來基本一樣。
如果出現不同或量不一樣，說明擴增前某一步的酶操作效率可能是太低了。
15. 用 pH 8.0 0.25× 的 TE 緩沖液按 1：100 稀釋反應產物。
16. 配制第二輪擴增反應。在兩塊 96 孔板上兩兩混合 12 個 CP28X1 X2 引物和 16 個 MLDY1Y2 引物（每個樣品 192 個不同的反應；每個 20 ul）：
2.0 ul 模板（稀釋的第一輪擴增產物）
2.0 ul 10× PCR 緩沖液
1.5 ul 20 mmol/L MgCl2
0.4 ul 10 mmol/L 標準 dNTP
2.0 ul 4 umol/L 引物 CP28 X1X2（X2＝A、C、G 或 T）
2.0 ul 4 pmol/L 標記的引物’MLlSY1Y2（Y2＝A、 C、G 或 T）
2.0 ul RediLoad
7.9 ul H2O
0.2 ul 5 U/ul Tag DNA 聚合酶
確保每個反應，第一輪和第二輪使用的一致的 X1 和 Y1。
17. 運行步驟 13 的程序，但只要 20 個循環。用瓊脂糖凝膠電泳檢查是否擴增成功 （也見步驟 13）。
18. 每個反應轉移 5 ul 到新裝有 5 ul 甲酰胺緩沖液的 96 孔板上。75°C 變性 2 min。
19a. 放射性標記樣品：取 1～2 ul 上樣于 6％ 的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
19b. 非放射性標記使用直接印跡電泳。
收起
注意事項
其他
1. 材料
50 ug 總 RNA
2. 試劑
無 RNase 的水，
10 umol/L cDNA 引物 CP29V： 5'-ACC TAC GTG CAG ATT TTT TTT TTT TTT TX1-3（X1＝A、C或 G；三種堿基的摩爾數相等），
100 mmol/L 無 RNase 的 DTT（Life Technologies），
5× SuperScript 緩沖液（Life Technologies），
10 mmol/L 無 RNase 的標準 dNTP，
40 U//ul 的 RNase 抑制劑（如 RNasin），
200 U/ul SuperScript II 逆轉錄酶（Life Technologies），
75× 第二鏈緩沖液 II，
1.5 U/ul RNase H，
10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 I，
pH 8.0 的 TE 緩沖液平衡的酚，
氯仿，
20 mg/ml 糖原，
28％（m/V）PEG 8000/3.6 mmol/L MgCl2，
70％ 和 100％ 乙醇，
10× 通用緩沖液（Stratagene），
4 U/ul MboⅠ 限制酶（Stratagene），
3 mol/L 乙酸鈉，pH 5.2，
10 mmol/L ATP，
0.5 ug/ul MboⅠ-連接子 ML 2025，
T4 DNA 連接酶和 10× 緩沖液（Roche），
1× 和 0.25× TE 緩沖液，pH 8.0，
4 umol/L 引物 CP28X1：5'-ACC TAC GTG CAG ATT TTT TTT TTT TTT TX1-3'（X1＝A、C 或 G），
4 mmol/L 引物 ML19Y1： 5'-TGC TAA GTC TCG CGA GAT CY1-3'（Y＝A、 C、 G 或 T），
10× PCR 緩沖液，
20 mmol/L MgCl2，
RediLoad（Reserch Genetics），
5 U/ul Taq DNA 聚合酶，
100 bp DNA 分子質量參照物（如 Life Technologies），
1.5％（m/V）瓊脂糖凝膠，
4 umol/L 引物 CP28X1 X2： 5'-ACC TAC GTG CAG ATT TTT TTT TTT TTT TX1X2-3'（X2＝A、C、 G、T），
4 umol/L 引物 ML19Y1 Y2 ： 5'-TGC TAA GTC TCG CGA GAT CY1 Y2-3'（Y＝ A、C、G 或 T），
甲酰胺緩沖液：含 5 mmol/L EDTA/0.1％ 溴酚藍的 99％ 去離子甲酰胺。
3. 耗材
22°C、37°C、42°C、65°C 和 75°C 水浴，加熱塊或類似的儀器，
有熱蓋的熱循環儀，
96 孔 PCR 板（如 MJ Reserch）。