高壓液相色譜（HPLC）系統組成（二）

四、檢測器 
    
檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。 

1．分類 
1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器 （如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數、壓電石英頻率）、放射性檢測器 （閃爍計數、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。 

2）按測量性質可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。 

3）按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。 
4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。 
2．性能指標 
1）噪音和漂移：在儀器穩定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。 

2）靈敏度（sensitivity）：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·s/g。 

3）檢測限（detection limit） 
    檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。

檢測限指恰好產生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度--注意與分析方法檢測限的區別，單位g/ml或mg/ml；對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度（detectability）。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。 

    
檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。 

4）線性范圍（linear 
range）：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應信號的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters 
996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。 
    
定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關系。輸出信號與樣品量zui好呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內呈線性響應。通常A＝BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。對大多數檢測器來說，x只在一定范圍內才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。 

    
線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。 
5）池體積：除制備色譜外，大多數HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2µl甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。 

3．紫外檢測器（ultraviolet detector） 
    
UV檢測器 是HPLC中應用zui廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產生漂移。 

    注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。 
    
中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40，在241~250nm范圍內不得過0.20，在251~300nm范圍內不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。 

    
UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比. 
    UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器（photodiode array 
detector，PDAD）。按光路系統來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質），色譜用于定量。常用于復雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。 

4．與檢測器有關的故障及其排除 
1）流動池內有氣泡 
    
如果有氣泡連續不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現許多線狀"峰"，這是由于系統內有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統是否漏氣，再加大流量驅除系統內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（zui好不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內增壓，然后放開。可反復操作數次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。 

2）流動池被污染 
    
無論參比池或樣品池被污染，都可能產生噪音或基線漂移。可以使用適當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。 

3）光源燈出現故障 
    紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產生嚴重噪音，基線漂移，出現平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。 
4）倒峰 
    
倒峰的出現可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數低于流動相的折光指數，也會出現倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。 

五、數據處理和計算機控制系統 
    
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數據；②控制儀器；③色譜系統優化和專家系統。 

六、恒溫裝置 
    在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。