一、范圍
本標準規定了測定動物食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羥孕酮殘留量的方法及測定高效液相色譜儀串聯質譜儀的方法。本標準適用于肌肉、脂肪、肝、腎、乳中醋酸甲羥孕酮和醋酸甲羥孕酮殘留量的測定。
二、規范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，只有注日期的版本適用于本文件。對于未注明日期的參考文件新版本（包括所有修訂）均適用于本文件。GB/T 6682分析實驗室用水規范和試驗方法。
三、原理
將醋酸甲羥孕酮和醋酸甲羥孕酮分別用乙腈、正己烷脂質體、混合陽離子柱純化，用甲醇洗脫，用高效液相色譜法（HPLC）串聯質譜法測定，用內標法定量測定。
四、試劑與材料
除另有規定外，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。
4.1 試劑
4.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。
4.1.2甲醇（CH3OH）。
4.1.3甲酸（HCOOH）：色譜純度。
4.1.4 乙酸（CH 3 COOH）。
4.1.5正己烷（C6H14）。
4.1.6乙酸乙酯（CH3COOC2H5）
4.1.7乙酸銨（CH 3 COONH 4）。
4.2 溶液配制
4.2.1mol/L醋酸銨緩沖液：醋酸銨15.4g，加入水900 ml溶解，用醋酸調節pH值至5.2，用水稀釋至1000 mL。
4.2.2 2%甲酸水溶液：取甲酸2ml，加水溶解，稀釋至100ml。
4.2.30.1%甲酸水溶液：取1ml甲酸溶于水，稀釋至1000 mL。
4.2.4 50%甲醇水溶液：取甲醇50ml，加水溶解，稀釋至100ml。
4.2.530%甲醇溶液：30mL甲醇，溶于水，稀釋至100mL。
4.2.6 0.1%甲酸乙腈水溶液：取0.1%甲酸水溶液20ml，加乙腈溶解，稀釋至100ml，混勻。
4.3 標準品
醋酸甲地孕酮和醋酸甲地孕酮的含量為98.0%。
4.3.2內標：醋酸甲羥孕酮，含量≥98.0%。
4.4 標準溶液制備
4.4.1標準液：獲得約10 mg醋酸甲羥孕酮和10 mg醋酸甲羥孕酮。在100 ml棕色瓶中，用乙腈溶解稀釋，制得濃度為0.1mg/mL的醋酸甲羥孕酮和醋酸甲羥孕酮標準溶液。-保質期為6個月。
4.4.2內標儲存液：取醋酸甲羥孕酮標準品10mg左右，精密稱定，用100mL棕色量瓶溶解，用乙腈稀釋至刻度，制備0.1mg/mL甲羥孕酮儲備液。-20℃保存6個月。
4.4.3混合標準溶液：精密測量醋酸甲地孕酮和醋酸甲羥孕酮標準品貯備液0.5mL，用50mL棕色溶液中乙腈稀釋至刻度，配制濃度為1μg/mL的混合標準溶液。儲存在4℃以下，為期1個月。
4.4.4內標工作液：準確測量0.5mL內標原液，用乙腈稀釋內標原液，制備濃度為1g/mL的內標工作液。儲存在4℃以下，為期1個月。
4.4.5 標準曲線的制備
通過使用適當量的標準工作液和內標工作溶液，制備濃度為2,5,25,50和100ng/ml的一系列標準溶液(內標20ng/ml)。以特征離子色譜峰面積比為縱坐標，以標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。
4.5 材料
4.5.1混合陽離子固相萃取柱：60mg/3mL，或等效物。
4.5.2β-葡萄糖苷酶/芳基硫酸酶。
4.5.3微孔膜：0.22μm。
五、儀器和設備
5.1高效液相色譜串聯質譜儀：分布噴霧離子源。
5.2分析平衡：意義0.00001g和0.01g。
5.3 氮吹儀。
5.4渦流混合器：3000r/min。
5.5 超聲波萃取儀。
5.6液體轉移槍：200、L、1mL、5mL。
5.7離心機：10000 r/min。
5.8.梨瓶：100 mL。
5.9 旋轉蒸發器。
5.10固相萃取裝置。
六、試料的制備與保存
6.1 試料的制備
取適當量的新鮮或未冷凍的空白或試驗組織，絞碎，混勻。脂肪組織在60℃的水浴中融化。
以均質試驗樣品為試驗材料。
以均質化空白樣品為空白樣品。
_在均質化后取出空白樣品，加入適當濃度的標準工作液，并將樣品添加為空白。
6.2供試品的貯存溫度：18℃以下，3個月內分析測試。
七、測定步驟
7.1 酶解
取樣品2g(準確至20 mg)，在50 mL離心管中加入40 L內標工作液，加入0.2 mol/L乙醇酸乙酯緩沖液4mL，加入葡萄糖醛縮酶/芳基硫酸鹽酶稀釋液40&mU；L，37°；C，37°，12h。
7.2 提取
7.2.1 肌肉、肝臟、腎臟組織
酶解后，加入10ml乙酸乙酯，在渦流振蕩器上劇烈振蕩10min，以4000r/min離心5min，取上清液于梨形瓶中。再次用乙酸乙酯10ml再次提取殘余物，合并培養基并在50℃下蒸發至干燥。加入10ml乙腈和5ml正己烷溶解，移入50ml離心管中，低速渦流10s，3000r/min離心2min，丟棄正己烷層，旋轉下層溶液，50℃蒸干，加入3ml 30%甲醇水溶液，溶解備用。
7.2.2 脂肪組織
酶水解后，將樣品加入10ml乙腈并在渦旋振蕩器上劇烈振蕩0.5分鐘，在50°C下超聲提取10分鐘，在4000r/min離心5分鐘，將上清液轉移到另一個50ml離心管中。在殘渣中加入10毫升乙腈，再次提取。將上清液加入正己烷4ml，低速渦旋10s，用3r/min離心棄去正己烷層2min。加入4毫升正己烷并再次脫脂。下層旋轉，在50℃下蒸發至干燥。加入30％甲醇水溶液溶解3ml。
7.3 凈化
混合陽離子固相萃取柱分別用3ml甲醇和3ml水活化。取備用液通過塔，分別用水和3ml 50%甲醇溶液沖洗，排干。洗脫液用5mL甲醇洗脫，洗脫液經50℃干燥。C.氮下。用0.2ml乙腈（80%）-0.1%甲酸溶液溶解殘渣，旋渦混合，過0.22μm濾膜或15000轉/分高速離心10分鐘，取上清液，送高效液相色譜-串聯質譜儀測定。
7.4 測定
7.4.1 高效液相色譜儀參考條件
(A)柱：C18柱(50毫米、2.1毫米、1.7米)或同等；
b）流動相：A:0.1%甲酸乙腈，B:0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，見表1；
(C)流速：0.2mL/min；
d）柱溫：30 ℃；
e）進樣量：10μl。
7.4.2 質譜參考條件
a）離子源：電噴霧（ESI）離子源；
b）掃描方式：正離子掃描；
c）檢測方式：多反應監測；
d）電離電壓：3000 V；
e）源溫：100 ℃；
f）霧化溫度：350℃；
g）錐孔氣流速：25 L/h；
h）霧化氣流速：450 L/h；
i)定性離子對、定量離子對和碰撞能量示于表2中。
7.4.3 測定法
取樣品溶液和標準溶液進行單點或多點校準，按內標法峰面積比計算。樣品溶液和標準溶液中醋酸甲羥孕酮與氘代甲孕酮的峰面積比值應在儀器檢測的線性范圍內。與標準溶液相比，樣品溶液的離子相對豐度滿足表3的要求。附錄A顯示了醋酸甲羥孕酮、醋酸甲羥孕酮和氘化甲孕酮的特征離子質量色譜圖譜。
7.5 空白試驗
除不加試料外，均按上述測定步驟進行。
八、結果計算和表述
試樣中待測藥物的殘留量按式（1）計算：
式中：
x-待測試物質的殘留量，以每公斤微克計(微克/千克)；
Cs——標準工作溶液中受試物的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
C樣品溶液中內標物濃度為每毫升(ng/ml)；
cis——標準工作溶液中內標物的濃度，單位為ng/ml；
A—試樣溶液中被測物質的峰面積；
A為標準工作液內標的峰值面積；
A為樣品溶液中內標物的峰面積；
被測物質在AS標準工作液中的峰面積；
V——試樣溶液定容，單位為毫升（ml）；
m —試料質量，單位為克（g）。
計算結果需從空白值扣除。測量結果用兩次平行測定的算術平均值表示，并保留三位有效數字。