黃行許教授連發CRISPR研究成果

　　南京大學模式動物研究所的黃行許（Xingxu Huang）教授，是近年來基因組編輯領域的風云人物之一。其實驗室不僅首次在世界上利用CRISPR/Cas9進行了大鼠的條件性基因敲除，還通過原核注射實現了世界上首次猴基因敲除，這些成果在國際上受到廣泛的矚目。近期，黃行許教授課題組接連在CRISPR/Cas9研究中取得突破性成果，相關論文發表在Nature Methods、Cell Research、Scientific Reports和Human Molecular Genetics等權威期刊。

　　在5月28日的Nature Methods雜志上，黃行許教授研究小組則與Wellcome Trust Sanger研究所的William C Skarnes展開合作，調查了Cas9基因改良小鼠的脫靶突變情況。他們采用全基因組測序，更全面地評估了注入Cas9與Cas9切口酶誘導的損害。證實在誘導出目的突變等位基因的同時，在受精卵中Cas9核酸內切酶誘導的非目的突變是非常稀少的。

　　6月5日發表在Cell Research雜志的一項研究中，黃行許課題組與南京大學劉江懷(Jianghuai Liu)教授研究小組合作，基于近期研究人員采用細菌II型CRISPR/Cas9系統，開展RNA引導基因編輯和轉錄編程研究中取得的一些技術突破，對非切割性dCas9/sgRNA作為序列特異性順式調控元件靶向平臺在人類細胞中的應用，進行了測試。

　　9月10日，黃行許課題組與西北農林科技大學、榆林學院等處的研究人員合作，將靶定兩個功能基因（MSTN和FGF5）的Cas9

　　mRNA和sgRNAs，共注射到單細胞階段的山羊胚胎中，成功地產生了一個或兩個基因被修飾的轉基因山羊。研究人員對成纖維細胞、以及建立者動物和死亡動物的身體組織和睪丸中靶基因的打靶和脫靶突變進行了詳細分析。結果表明，他們在大型動物中同時獲得了幾個位點的編輯，從而表明CRISPR/Cas9系統有潛力成為一種強大而高效的農業動物基因工程工具，因此用于繁殖將是極為重要和適用的。相關閱讀：我科學家用CRISPR獲得轉基因山羊。

　　另外，2月份在Scientific Reports雜志發表的另一項研究中，黃行許與第三軍醫大學的魏泓(Hong Wei)教授合作，采用將Cas9/sgRNA注入到受精卵中的方式有效構建出了轉基因豬。在受精卵中共同注入Cas9 mRNA和sgRNA已被證實是在不同物種中實現基因組改造的一種有效的基因編輯策略。

　　10月13日，黃行許教授聯手云南中科靈長類生物醫學重點實驗室、中科院動物研究所和中科院昆明動物研究所的研究人員，在國際著名期刊《Human Molecular Genetics》又發表一項CRISPR/Cas9研究成果，題為“CRISPR/Cas9-mediated Dax1 knockout in the monkey recapitulates human AHC-HH”。黃行許教授、云南中科靈長類生物醫學重點實驗室的季維智研究員和南京醫科大學特聘教授沙家豪，是本研究的共同通訊作者。

　　這項研究指出，DAX1基因突變可引發X連鎖先天性腎上腺發育不全（AHC）和促性腺激素分泌不足的性腺功能低下癥（HH），分別表現為原發性腎上腺皮質功能不全和不完整或缺少性成熟。來自Dax1基因敲除小鼠模型的結論，只能為AHC/HH疾病提供有限的見解。該研究小組之前在食蟹猴中成功實現了CRISPR/Cas9介導的基因組打靶。在這項研究中，研究人員描述了一個雄性胎猴，用CRISPR/Cas9進行基因組打靶，在其大多數身體組織和性腺中產生了Dax1無效突變。這只DAX1缺陷猴表現出腎上腺發育缺陷和異常的睪丸結構。Sertoli細胞的形成沒有受影響。這種表型與AHC-HH患者（DAX1突變引發的）中觀察到的現象非常相似。

　　研究人員進一步檢測了Wnt/β-catenin-VEGF信號在胎猴Dax1缺陷睪丸中的上調，從而將缺乏DAX1時信號通路的異常激活，視為AHC-HH的一個機制。這項研究，對于DAX1在HH中的作用，提供了新的見解，并為“通過CRISPR/Cas9介導的基因打靶制備人類疾病猴模型”提供了原理驗證。