3.4RNA放射性標記

[α32P]UTP 或 CTP(800Ci ml10mCi ml)UTP 或 CTPT4 多核苷酸激酶(γ32P)ATP牛小腸磷酸酶T4RNA 連接酶[32P]pCpATP2Oumol L無 tRNA 酶的牛血清白蛋白

10XT4 多核苷酸激酶緩沖液DEPC 處理的水10X 磷酸酶緩沖液TE(pH7.4)5mol LNaClTE(pH7.6)10XT4RNA 連接酶緩沖液DMSO

一材料與設備

1)[α³²P]UTP 或 CTP(800Ci/ml,10mCi/ml)。

2)UTP 或 CTP。

3)T4 多核苷酸激酶

4)10XT4 多核苷酸激酶緩沖液

5)(γ³²P)ATP(3000Ci/mmol；10mCi/ml)

6) 牛小腸磷酸酶

7)DEPC 處理的水

8)10X 磷酸酶緩沖液

9)TE(pH7.4)

10)5mol/LNaCl

11)TE(pH7.6)

12)T4RNA 連接酶

13)[³²P]pCp(3000Ci/mmol；lOmCi/ml)

14)10XT4RNA 連接酶緩沖液

15)DMSO

16)ATP，20umol/L。

17 無 tRNA 酶的牛血清白蛋白


二、操作方法

(一）RNA 內部標記

1) 在體外轉錄體系中加入 5ul[α³²P]UTP 或 CTP(800Ci/ml，10mci/ml），不加未標記的 UTP 或 CTP 或限制它們的濃度為 10?15umol/L, 孵育時間最長為 1 h

2)DNase 消化后，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 RNA, 純化標記的全長 RNA。

(二）5＇端標記 RNA

逋過 T4 多核苷酸激酶在 5＇端標記 RNA。這個酶將 [32P] 由 [γ-³²P]ATP 上轉移到分子的 5＇端. 伹 5＇端標記的 RNA 分子需要先用牛小腸磷酸酶去除非同位素的 5＇磷酸。

1) 用 DEPC 處理的水稀釋 1?2ugRNA 至終體積為 16ul,95℃ 下放置 2 min 后，冰浴5 min, 變性 RNA

2) 加入 2ul10X 磷酸酶反應緩沖液，2ul 牛小腸磷酸酶 (1U/ul);37℃ 反應 30 min

3) 用 TE(pH7.4) 稀釋 RNA 至終體積為 200ul, 加 6ul5mol/LNaCl 如前所述沉淀RNA。

4) 用 TE(pH7.6) 重懸 RNA 至 RNA 濃度為 0.5ug/ul。取 2ulRNA 溶液，95℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min

5) 加 10XT4 多核苷酸激酶緩沖液 4ul[γ³²P]ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml),iyT4 多核苷酸激酶 (3?6U/ul)，于 37°C 孵育 30 min

6) 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化已標記的 RNA

(三）3＇端標記 RNA

利用 T4RNA 連接酶和過量的 [32P]p4 以標記 RNA 的 3＇端

1) 將 1?2ugRNA 于 68℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min, 使之變性

2) 加入 4ul10XT4RNA 連接酶緩沖液，4ul DMSO，1ul20umol/LATP,1ul l0ug/ml 無 RNA 酶的牛血清白蛋白，1?2ug RNA,5?10ul[³²P]pCp(3000Ci/mmol,lOmCi/ml)，用 DEPC 處理水補足總體積 40ul。4°C 孵育過夜。

3) 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化已標記的 RNA。