在尿素或甲酰胺存在的條件下進行 RNA 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠破壞 RNA 的二級結構，使其電泳遷移率-與分子質量的對數成嚴袼的反比關系，同時其靈敏度要高于甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。
| 試劑、試劑盒 | 40% 聚丙烯酰胺溶液尿素甲酰胺5XTBE 緩沖液10X 加樣緩沖液過硫酸銨TEMED染色液 1%AgNO3顯色液 |
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| 儀器、耗材 | 垂直電泳裝置水浴 |
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| 實驗步驟 | (一）材料與設備
1) 垂直電泳裝置
2) 水浴
3)40% 聚丙烯酰胺溶液: 丙烯酰胺 38 g,N,N-亞甲雙丙烯酰胺 2 g，加水至 100 ml，完全溶解后過濾，保存于棕色瓶中
4) 尿素
5) 甲酰胺
6)5XTBE 緩沖液：Tris 堿 54 g, 硼酸 27.5 g，20 ml0.5md/LEDTA(pH8.0)，加水至 1L
7)10X 加樣緩沖液:10 mmol/LEDTA(pH8.0)，0.2% 橙 G，50% 甘油
S)10% 過硫酸銨
9)TEMED
10) 染色液 1%AgNO3
11) 顯色液:NaOH 10 g，Na2CO3 0.2 g，甲醛 2 ml 加水至 500 ml, 溶解完全后使用，需臨時配制。
(二）操作方法
1) 灌膠：根據所分離 RNA 分子的大小、參照寡核甘酸長度與聚丙烯酰胺百分濃度的關系（表 5.1) 選擇合適的膠濃度，并根據表 5.2 灌制變性聚丙烯酰胺凝膠
2) 預電泳:200V 條件下恒壓電泳 15?2Omin
3) 電泳: 在 RNA 樣品中加入等體積的甲酰胺，振蕩混勻，于 55℃ 加熱 5 min, 以消除二級結構。加入 10X 加樣緩沖液，200V 條件下用 0.5XTBE 電泳緩沖液恒壓電泳。
4) 快速銀染：電泳結束后，用蒸餾水洗膠兩次；加入適量的染色液染色 10 min; 水沖洗 30s, 用少量顯色液沖洗; 加入顯色液至條帶清楚。 收起 |
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| 注意事項 | 1) 灌膠后一旦拔去梳子，必須立即徹底清洗加樣孔，否則由梳子帶出的少量聚丙烯酰胺將會在孔中聚合，從而產生會使 RNA 條帶變形的形狀不規則的加樣孔底面
2) 最好用同批配制的電泳緩沖液配膠和電泳，因為離子強度或 pH 值的細微差異都會產生緩沖液前沿，使 RNA 的遷移發生嚴重變形
3) 在電泳前最好進行預電泳，使過硫酸銨遷移出樣品孔，并能將凝膠加溫至最適于 RNA 電泳的溫度
4) 在加樣緩沖液中加入常規示蹤染料溴酚藍和二甲苯青是不可取的，因為這些染枓或其中的雜質可能與 RNA 遷移速率相同，會干擾利用紫外吸收觀察 RNA 的效果 |
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