實驗概要
本實驗中C1q和DNA結合形成不溶性復合物,用DNA酶將結合的DNA裂解后,繼續用柱層析,可獲得純化的C1q。
主要試劑
1. pH值8.6、0.025mol/L巴比妥EDTA緩沖液(含0.01mol/L EDTA);
2. 小牛胸腺DNA;
3. pH值6.9、0.05mol/L PB;
4. DNA酶溶液,每毫升pH值6.9、0.05mol/L PB中含MgCl2 0.003mol/L、1mg DNase;
5. pH值5.3、0.3mol/L PB;
6. pH值5.1、0.02mol/L PB(含0.01mol/L EDTA);
7. 1mol/L NaCl。
主要設備
1. 磁力攪拌器;
2. 離心機(最好是恒溫高速);
3. 25×100cm和25×50cm層析柱各一支;
4. 電導儀;
5. Sephadex G200。
實驗步驟
1. 將血清裝入透析袋中,用pH值8.6、0.05mol/L巴比妥DETA緩沖液在4℃透析過夜,測定袋內外導電率和pH值是否相等,如相等,則表示透析完成,1000r/min,離心30min,除去非特異性沉淀物;
2. 按每毫升125μg加入DNA,室溫攪拌1h,4℃放置24h;
3. 1000r/min離心30min取沉淀物,用pH值6.9 PB洗4次;
4. 每毫升沉淀物中加入DNA酶溶液0.1ml,混懸液用1mol/L HCl調整pH值為6.9;
5. 37℃攪拌1h或室溫3h,將DNA消化,攪拌后放于pH值6.9、0.05mol/L PB中透析,直到沉淀物大部分溶解(透析液最好含MgCl2 0.3mmol/L和NaCl 0.05mol/L),10 000r/min離心30min,去除沉淀物;
6. 上清液過Sephadex G200柱(柱長100cm),用pH值5.3、0.3mol/L PB洗脫,以除去DNase和DNA消化產物,將C1q峰收集后,加2.8%硫酸銨使之沉淀(4℃),5h后離心沉淀,沉淀物溶于pH值7.0、0.1mol/L PB中,并用此緩沖液透析過夜,再離心除去不溶物,上清液即為純化90%以上的C1q,可用于雙擴散試驗,用于放射免疫試驗則需進一步純化;
7. 過柱濃縮物用pH值5.1、0.02mol/L PB(內含0.01mol/L EDTA)平衡,過羧甲基(CM)纖維素柱(柱長50cm),用平衡緩沖液加上限1mol/L NaCl作為梯度洗脫(電導率5~25mS之間),C1q在8mS電導時洗脫下來;
8. 洗脫物濃縮、分裝、低溫保存。