DNA自動序列測定試驗

[實驗原理]
DNA 測序（DNA sequencing）是對DNA 分子的一級結構的分析。其基本原理是DNA 的復制反應體系中需要存在DNA 聚合酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成雙鏈后，DNA 聚合酶在引物的引導下在模板鏈上沿3’→5’的方向移動，dNTP 按照堿基配對原則，逐個連接在引物的3’-OH 末端。然而，如果在DNA 合成體系中加入雙脫氧核苷三磷酸（2’,3’-ddNTP），后者與dNTP 的區別在于脫氧核糖的C3 位置缺少-OH，這樣，一旦2’,3’-ddNTP 摻入到DNA 鏈中，由于沒有3’-OH，不能同后續的dNTP 形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的引物鏈在此終止。
DNA 自動測序技術也采用了這一基本原理。即在反應體系中除了加入正常反應所必需的4 種dNTP 外，還加入了一定比例的4 種熒光染料基團標記的2’,3’-ddNTP，鏈合成過程中，dNTP 和熒光染料基團標記的2’,3’-ddNTP 處于一種競爭狀態，結果DNA 合成反應的產物是一系列長度不等的具有熒光信號的多核苷酸片段，借助計算機自動數據處理最終得到 DNA 堿基的排列順序。
[試劑與儀器]
試劑：1. BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit:
⑴ Ready Reaction Mix; ⑵ 陽性對照模板和引物; ⑶ BigDye Terminator v3.1Sequencing Buffer (5×)。
2. 目的基因測序引物。
3. 100%乙醇；125mM 的EDTA；3M 醋酸鈉（pH 5.2）；70%乙醇。
4. Hi-Di 甲酰胺。
易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
儀器：1. MicroAmp? 96-Well Reaction Plate；
2. PCR 擴增儀（GeneAmp PCR System 9700）；
3. 低溫高速離心機；
4. DNA 序列分析儀（ABI 公司3130 基因分析儀）。
[操作方法]
1. 模板的準備（PCR 擴增產物）
⑴ 目的基因的擴增與純化：
一般來說，任何可以去除dNTPs 和引物的方法都是可行的。這里推薦使用Microcon-PCR單個樣品PCR 產物純化柱（Millipore, #1045062）。
⑵ 確定PCR 擴增并純化后的目的基因的質量：
應用瓊脂糖凝膠電泳法檢測純化后目的基因的質和量。對測序用PCR 產物的量的要求見下表。
PCR 產物 應用量
100–200 bp 1-3 ng
200–500 bp 3-10 ng
500-1000 bp 5-20 ng
1000-2000 bp 10-40 ng
>2000 bp 20-50 ng
2. 測序反應
⑴ 測序反應混合物的準備：按下列比例配制。
Ready Reaction Premix (2.5×) 2μl
BigDye Sequencing Buffer (5×) 1μl
引物 3.2 pmol
模板 見PCR 產物應用量
去離子水 至10μl
總體積 10μl
⑵ 測序反應的條件：
96℃1min→（96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min）×25 循環→4℃ 保溫
3. 測序反應后產物的純化
應用乙醇/EDTA/醋酸鈉法對測序反應后產物進行純化。具體方法為：
⑴按順序直接向每個測序反應體系中加入1μl 的125mM 的EDTA，1μl 的3M 醋酸鈉和25μl的100%的乙醇，充分混勻；
⑵室溫孵育15min 后，4℃條件下，14000rpm，離心15min；
⑶小心去除液體部分后，向每個測序反應體系中加入70μl 的70%的乙醇；
⑷4℃條件下，14000rpm，離心8min；
⑸小心去除液體部分，干燥后備檢。
4. 制備3130 測序電泳樣品
直接向純化后的樣品管中加入10μl 的Hi-Di 甲酰胺，95℃變性3min→迅速冰冷3min。
然后將樣品放入3130 樣品載樣盤上，備檢。
5. 3130 電泳操作：見如下所列電泳參數。
6. Data Collection v2.0 軟件操作：
①新建Instrument Protocol：在Data Collection v2.0 軟件的樹形瀏覽窗依次點擊GAInstruments > ga3100 / ga3100-Avant > Protocol Manager；在Instrument Protocol 窗口點New 打開Protocol Editor 對話框；完成編輯：輸入一個名字；在Type 下拉菜單選擇REGULAR；在Run Module 下拉菜單選擇HIDFragmentAnalysis36_POP4_1；在Dye Set下拉菜單選擇G5。OK。
②新建Results Group：在Data Collection v2.0 軟件的樹形瀏覽窗依次點擊GA Instruments> Results Group；點New 打開Results Group Editor 對話框；在General tab 輸入名字；在Analysis tab 設置自動分析；在Destination tab 設置數據保存路徑；在Naming tab 設置數據文件和文件夾名稱；在Automated Processing tab 設置數據自動處理方式。OK。

③新建GeneMapper ID Software Plate Record 用于自動分析：在Data Collection v2.0 軟件的樹形瀏覽窗依次點擊GA Instruments > ga3100 / ga3100-Avant > Plate Manager；完成New Plate 對話設置：名稱，在Application 下拉菜單選擇GeneMapper-Generic(手工分析)或者GeneMapper-<Instrument name>(自動分析)，輸入板型、操作者名稱等，OK，打開編輯窗口，完成樣品表(Plate Record)。將樣品板組裝好，放到3100 上；找到Plate Record并選中它，然后點擊對應樣品板的plate position indicator，點擊RUN 按鈕開始電泳。
[結果判斷]
全自動DNA測序工作站會自動地完成對樣品DNA的堿基序列分析，然后把分析完成后的結果數據以樣品文件的形式保存于計算機的硬盤中。分析好的樣品文件可以用序列分析軟件來打開查看結果。電泳信號圖的X軸表示時間，Y軸表示相對熒光強度，圖上不同顏色的信號代表了四種不同的堿基，圖中的每個峰代表一個DNA片段。