Luciferase 報告基因技術
自然界中廣泛分布著生物發光有機體，其中包括細菌、真菌、魚、昆蟲等。
在這些生物發光有機體中催化生物發光反應的各種酶都稱之為熒光素酶
（Luciferases），底物則命名為熒光素（Luciferin）。自1986— 1987 年首次被當作
報告基因使用以來，熒光素酶基因已成為目前運用最廣泛的報告基因之一。盡管
來自不同物種的熒光素酶及底物存在有很大的差異，但有一個共同點，即在生物
發光反應體系中均需發生氧化反應。它通過兩個步驟使底物熒光素發生氧化作
用，而產生發光反應，此反應是ATP 依賴性的。雜環熒光素首先腺苷化，然后
通過氧化脫羧作用，產生AMP、CO2，并通過激活的熒光素中間產物發射光。
將反應所需的試劑與含有熒光素酶的細胞裂解液混合即會產生一種迅速衰
減（在一秒鐘內）的黃綠色閃光（發射峰560 nm），這種光信號可用配備了便于
迅速混合反應物的自動注射裝置的熒光檢測儀（Luminometer）進行檢測，也可
用標準的液閃儀對光信號進行記錄。當底物過量時，發光量的總值與樣品的熒光
酶活性成正比，因此，可對熒光素酶報告基因的轉錄進行間接估計。熒光素酶易
被蛋白酶降解，在轉染的哺乳動物細胞中的半衰期約為3 小時。熒光素酶報告系
統為啟動子活性的檢測提供了一個敏感、快速、非放射性的檢測方法。
實驗步驟：
1．實驗第一天，消化并接種細胞（根據具體實驗選擇合適的細胞）于35mm 細
胞培養皿，置于5％ CO2、飽和濕度的37℃培養箱內培養過夜。
2．等細胞密度達到70％ 時用Luciferase 報告基因質粒、LacZ 的表達質粒及其
它質粒（根據具體實驗確定）共轉染細胞（根據具體實驗選擇轉染方法，如
磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000 等均可）。
3．轉染24－36 小時后，吸去培養液，用冰冷的PBS 洗滌細胞。
注：熒光酶的酶促反應會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉染的細胞在收集
細胞前應充分洗滌除去含鈣介質。
4．在每個培養皿中加入350 μl 預冷的harvest buffer,于4 oC 或冰上放置10 min
裂解細胞。
5．在細胞裂解期間，準備足量的1.5 mL 微量離心管，將ATP buffer 與luciferin
buffer 以1：3.6 比例混合成反應液后分裝，每管100μl。
6．依次取等體積的細胞裂解液（100μl）至步驟5 中的離心管中，迅速混勻，在
發光儀（Luminometer）上讀取吸光值。
注：發光反應會迅速衰減，將細胞裂解液加入反應液后5 秒內必須讀取吸光
值。
7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。
8．取剩余裂解液測定LacZ 的活性，其讀數作為內標用以矯正熒光素酶的讀數。
9. 用矯正后的讀數作圖，分析數據。
注：熒光素見光易氧化，已稀釋未用的熒光素應丟棄。
實驗試劑：
（1）harvest buffer (25 ml)：
1.25 ml 1 M Tris-HCl(pH7.5), 25 μl 1 M DTT, 250 μl 10% Triton X-100, 加水
至25 ml，4oC 保存。
（2）ATP buffer (10 ml)：
1.25 ml 1 M Tris-HCl(pH7.5), 250 μl 1 M MgCl2, 24 mg ATP, 加水至10 ml
-20oC 保存。
（3）luciferin buffer (36 ml)：
10 mg luciferin, 36 ml 5 mM KH2PO4 (pH7.8), 4oC 保存。
（4）PBS:
20 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, 4oC 保存。