MTT法細胞活性檢測實驗步驟

MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍，是一種黃顏色的染料。MTT主要有兩個用途：（1）藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養的細胞毒性的測定；（2）細胞增殖及細胞活性測定。

MTT方法能簡單、快捷、準確地測定細胞的增殖反應，并且其價格低廉，成為日前各實驗室檢測細胞活性的首選方法之一。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值）來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。

一、MTT 溶液的配制

1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml，須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市面上一般MTT的包裝為100mg，250mg或1g。對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。具體做法：預先在50ml離心管（沒有的話，可用培養瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻。可以重復幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內。將MTT完全混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20℃。按細胞培養板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加。

2、注意事項：

（1）在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。

（2）配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感。

（3）MTT一般最好現用現配，過濾后4℃避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用。

（4）MTT有致癌性，使用時需小心。

二、MTT甲瓚溶解液

1、二甲基亞砜DMSO：可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養液，在去除培養液的過程中，可能會把結晶去掉，導致結果不穩定。

2、三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，用雙蒸水溶解配成100ml溶液，該溶解液不需去除原培養基，但溶解較慢。該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。

三、MTT法實驗步驟

1、胰酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。

2、將細胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。

注意：因細胞在混勻后仍要繼續沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加6個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT的結果至關重要。

3、將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物。原則上，細胞貼壁后即可加藥（兩小時——半天時間），但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100ul，設3-5個復孔，建議設6個，否則難以反應真實情況。 

注意：對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養液全部吸走后再加藥，應該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。

4、5%CO2，37℃孵育16-48h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。 

5、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。 

6、終止培養，準備溶解結晶。

溶解結晶的方法有兩種，用DMSO溶解：

1)用DMSO溶解： MTT加入培養4h后，結晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結果的損失。 

2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

另一種方法，用三聯溶解液：

1) MTT加入培養4h后，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。）

2) 放入培養箱中繼續孵育4—6小時，鏡下觀察，待結晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右，紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會長一些。

7、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。

四、MTT結果分析

關于如何計算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm：lg 最大劑量

I：lg(最大劑量/相臨劑量)

P0：陽性反應率之和

Pm：最大陽性反應率

Pn：最小陽性反應率

MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。